In Vıvo Evrimsel Mühendislik Yöntemiyle Bora Dirençli Bacillus Boroniphilus Bakterisinin Geliştirilmesi

Abstract

Endüstriyel öneme sahip bor elementinin bitkiler için de hayati öneme sahip olduğu saptanmıştır. Bununla birlikte, gittikçe artan yeni bulgular borun sadece bitkiler için değil aynı zamanda insanlar da dahil olmak üzere ökaryot ve prokaryotlar için gerekli bir element olduğunu göstermektedir. Bor biyolojik sistemlerde, örneğin bitkilerde, hücre duvarında yapısal ve fonksiyonel role sahip olma, quorum-sensing moleküllerin yapısında yer alma gibi geniş bir spektrumda işlev görmektedir. Ayrıca, Türkiye’nin Kütahya ili Hisarcık mevkii yakınlarından alınan borca zengin topraklardan bora karşı oldukça dirençli yeni bir Bacillus türü olan Bacillus boroniphilus izole edilmiştir. Yapılan tüm çalışmalara rağmen hala borun hücresel cevaptaki rolü hakkında kesin bir bulguya ulaşılamamıştır. Tarımda bor eksikliği ve toksisitesinin ürün eldesini önemli oranda engellediği bilinmektedir. Bor transport ve regülasyon mekanizması ile boru tanıyan ve bağlanan özelleşmiş proteinlerin saptanmasının borun kullanıldığı nanobiyoteknolojik ve endüstriyel uygulamalarda etkinliğin artırılmasında yardımcı olacağı düşünülmektedir. Arzu edilen fenotipe ait seçici stres koşulunun uygulanmasına dayalı evrimsel mühendislik yöntemi çeşitli hücresel özelliklerin geliştirilmesi ve uygulanması için her geçen gün daha etkin bir şekilde kullanılmaktadır. Bu çalışmada ‘in vivo’ evrimsel mühendislik yöntemi ile gittikçe artan bor stres seviyesi altında yapılan seçilim ile B. Boroniphilus bakterisinin bora karşı direncinin arttırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla çalışmada bor konsantrasyonu en son 300mM’a kadar çıkartılarak 50 mutant nesil elde edilmiştir. Elde edilen populasyonların bora karşı direnç değerlerinin oldukça heterojen olduğu gözlemlenmiştir. Buna ek olarak, en son populasyondan birey kolonileri elde edilmiş olup bunların demir, bakır, çinko, krom ve çeşitli endüstriyel öneme sahip başka streslere karşı dirençleri analiz adilmiştir. Ayrıca bu bireylerin bor içerikleri atomik absorpsiyon spektrometresi (AAS) ile ölçülmüştür. Son olarak yabani tip bireyler ile en dirençli mutant bireyin transkriptomik analizi yapılmıştır. Bu çalışma evrimsel mühendislik yönteminin, B. boroniphilus bakterisinin bora karşı direncinin geliştirilmesinde yararlı bir yöntem olduğunu göstermiştir.

Boron is an industrially important element, but also an essential element for plants. There is increasing evidence that boron is also an essential element in eukaryotes, including humans and prokaryotes. It has a broad role in biological systems, such as being essential to the structure and function of plant cell walls, being a part of quorum-sensing molecules in some bacteria, etc. Additionally, a highly boron-tolerant bacterium Bacillus boroniphilus has been isolated from boron-rich soil near Hisarcık in Kütahya, Turkey. However, very little is known about the cellular response of living systems to boron stress, i.e. boron deficiency and toxicity. In agriculture, boron deficiency and toxicity is a major problem that impedes crop growth. Understanding the mechanisms of boron transport and regulation, and identification of proteins that specifically recognize and bind boron could be useful in various industrial and nanobiotechnological applications that involve boron. Evolutionary engineering based on applying selective pressure towards a desired phenotype is becoming increasingly utilized in improving and tailoring various cellular properties. In this study, we have employed an ‘in vivo’ evolutionary engineering strategy to further improve the boron-resistance of B. boroniphilus by selection under gradually increasing boron stress levels. Fifty mutant generations were obtained that were resistant up to 300 mM boron concentration, a highly toxic level. However, the resistance values of the mutant populations were highly heterogeneous. Moreover, boron-resistant individual colonies were also analyzed with respect to their potential cross-resistances to metals such as cobalt, iron, copper, chromium and zinc, and other industrially important stress types. Significant resistances against iron, copper and freeze-thaw stresses were observed. Besides, boron content of individuals were measured via Atomic Absorption Spectroscopy (AAS). Lastly, transcriptomic analysis was performed for wild-type and the most resistant mutant individual. This study showed that evolutionary engineering is a useful strategy in further improving boron-resistance in B. boroniphilus, a very specific bacterium. This research was supported by BOREN and Turkish State Planning Organization.