Valorization of industrial food wastes by production of phenolic antioxidants via fermentation with newly isolated Aspergillus spp.

Abstract

Gıda endüstrisinde üretimden çok miktarda katı ve sıvı atık açığa çıkmaktadır. Gıda endüstrisi atıklarının önemli bir bölümünü meyve ve sebze atıkları oluşturmaktadır. Bu atıkların çevre kirliliğine sebep olmalarının yanısıra düşük ekonomik değeri olan ürünlere (hayvan yemi, gübre vb.) dönüştürüldüklerinde değerli biyokütle ve besin maddelerinin kaybı söz konusudur. Bu nedenle değerlendirilmeleri ekolojik ve ekonomik fayda sağlamaktadır. Meyve ve sebze atıkları beslenme açısından önemli diyet lifi, vitaminler, pektin, yağ asitleri ve antioksidanlar gibi birçok bileşen içermektedir. Bu bileşenlerin atıklardan eldesi yoluyla biyoaktif ürünler üretmek mümkündür. Fermantasyon, biyoteknolojik olarak mikrobiyal enzimlerin ve biyoaktif ürünlerin üretiminde düşük maliyetli ve çevre dostu olması sebebiyle tercih edilen teknolojilerden biridir. Gıda atıklarının azaltılması ve değerlendirilmesi gıda alanında yapılan güncel araştırma konularından biridir. Bu tez çalışmasında, yerel kaynaklardan yeni Aspergillus türleri izole edilmiştir. İzole edilen bu küflerin hidrolitik enzim üretme kabiliyetleri incelenmiş ve bazı endüstriyel gıda atıklarından fenolik maddelerin elde edilmesi amacıyla kullanılmıştır. Bu doğrultuda, izole edilen küflerin hidrolitik enzim üretme potansiyelleri hem katı hem de sıvı besiyeri ortamında değerlendirilmiştir. Fenolik madde üretimi için en uygun gıda atıklarının belirlenmesi amacıyla, atıkların hem kimyasal kompozisyonu hem de fenolik madde içeriği belirlenmiştir. Atıkların izole edilen küflerle fermantasyonu sonucu en yüksek sonuç veren küfler için gerekli fermantasyon koşulları, Plackett-Burman deney tasarım (PBD) metodu ve sonrasında yanıt yüzey metodolojisi (RSM) kullanılarak optimize edilmiştir. Elde edilen fenolikçe zengin fermente atıklar, model bir gıdada fonksiyonel bileşen olarak kullanılmıştır. Tezin ilk bölümünde, Aspergillus section Nigri üyesi küflerin izolasyonu için çürümüş havuç, elma, incir, üzüm, mısır, kayısı, sarımsak, soğan gibi farklı meyve ve sebzeler kullanılmıştır. Besiyeri üzerinde gelişme gösteren sekiz adet siyah küfün moleküler ve morfolojik tanımlamaları yapılmıştır. Üzüm ve hurmadan izole edilmiş altı Aspergillus türü, Aspergillus tubingensis ZDM1 ve ZGM5, Aspergillus niger ZDM2 ve ZDM3, Aspergillus japonicus ZGM4 ve Aspergillus aculeatus ZGM6, ITS gen dizilimi kullanılarak adlandırılmış ve daha sonraki aşamalarda kullanılmıştır. Tezin ikinci kısmında, seçilmiş Aspergillus türlerinin hidrolitik enzimleri (selülaz, tannaz ve pektinaz) üretme potansiyelleri hem katı hem de sıvı besiyerinde incelenmiştir. Aspergillus izolatları hem katı hem de sıvı ortamda incelenen enzimleri üretmiştir. En yüksek selülaz aktivitesi A. japonicus ZGM4 ve A. aculeatus ZGM6 tarafından sırasıyla 40 ve 35 U/g kuru biyokütle olarak belirlenmiştir. Bütün izolatlar, 24 saatlik inkübasyondan sonra 150-343 U/g kuru biyokütle aralığında değişen tannaz aktivitesi göstermiştir. En yüksek pektinaz aktivitesi sırasıyla 130 ve 117 U/g kuru biyokütle aktivite gösteren A. tubingensis ZGM5 ve A. aculeatus ZGM6 türlerinde bulunmuştur. Elde edilen bulgulara göre, dört Aspergillus türü (A. niger ZDM2, A. tubingensis ZDM1, A. japonicus ZGM4 ve A. aculeatus ZGM6), yüksek hidrolitik enzim üretmeleri sebebiyle daha sonraki aşamalarda yapılacak olan fermantasyon çalışmaları için seçilmiştir. Tezin üçüncü bölümünde, elma kabuğu ve posası, nar kabuğu ve çekirdeği, kestane kabuğu ve kara havuç posasının fermantasyonda kullanım olanaklarının belirlenmesi için içerdikleri gıda bileşenleri tespit edilmiştir. Kimyasal bileşimlerini belirlemek amacıyla protein, indirgen şeker, serbest glukoz, kül, mineral (K, Ca, Mg, Na, Cu, Fe, Mn, Zn) ve tanen miktarları ölçülmüştür. Atıklardan hem serbest hem de çözünmez-bağlı formdaki fenolik bileşenler sırasıyla metanolik ve alkali ekstraksiyon yöntemleri ile ekstrakte edilmiş ve toplam fenolik madde (TPC) ve flavonoid (TFC) içeriği ve antioksidan aktiviteleri (DPPH, CUPRAC) belirlenmiştir. Ayrıca atıklardaki fenolik maddelerin tanımlama ve miktar tayinleri RP-HPLC ile gerçekleştirilmiştir. Protein nar çekirdeğinde en fazla bulunurken, en fazla mineral miktarı nar kabuğu ve kara havuç posasında bulunmuştur. İndirgen şeker miktarı en fazla nar kabuğunda bulunurken, glukoz en fazla elma posasında bulunmuştur. Kara havuç posası mineraller açısından zenginken nar kabuğunun yüksek miktarda kalsiyum ve potasyum içerdiği tespit edilmiştir. Kestane kabuğu, diğer atıklarla karşılaştırıldığında tanen içeriği en yüksek olan atıktır. Atıkların fenolik bileşen miktarına bakıldığında, nar kabuğunun en yüksek TPC ve antioksidan aktiviteye sahip olduğu ve bunun yüksek punicalagin içeriği ile ilişkili olduğu sonucuna varılmıştır. Fenolik maddelerin çoğunluğu nar kabuğu ve çekirdeğinde serbest formda bulunurken diğer atıklardaki fenolik maddelerinin %45'inden daha fazlasının bağlı formda olduğu saptanmıştır. Kestane kabuğundan elde edilen bağlı fenolik ekstraktı serbest fenolik ekstraktına göre daha fazla antioksidan aktivite göstermiştir. Atıkların serbest ve bağlı formda bulunan çeşitli fenolikleri içerdiği saptanmıştır. Atıkların TPC ve TFC değerleri ile antioksidan aktiviteleri arasında pozitif bir korelasyon tespit edilmiştir. Elma ve kestane kabukları yüksek bağlı fenolik madde içerikleri dolayısıyla daha sonraki fermantasyon çalışmaları için seçilmiştir. Tezin dördüncü bölümünde, elma kabuğu ile hazırlanan besi ortamında dört farklı küf (A. aculeatus ZGM6, A. japonicus ZGM4, A. niger ZDM2, A. tubingensis ZDM1) ile fermantasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla elma kabuğu ile hazırlanan besi ortamında 7 gün boyunca katı yüzey fermantasyonu gerçekleştirilmiş ve belirli aralıklarda örnekler alınarak TPC ve antioksidan aktivitedeki değişim incelenmiştir. Aspergillus spp. ile fermantasyon sonucunda elma kabuğundaki TPC ve antioksidan aktivitenin arttığı görülmüştür. En fazla artış A. niger ZDM2 ve A. tubingensis ZDM1 türleriyle fermente edilen elmalarda tespit edilmiştir. Bu türler ile fermente edilen elma kabuklarının antioksidan aktivitesinde fermente edilmemiş elma kabuğuyla kıyaslandığında CUPRAC ve DPPH yöntemlerinde sırasıyla 3 ve 4 kat artış saptanmıştır. Fermente edilmemiş elma kabuğunda bulunan fenolikler LC-MS/MS ile tanımlanmış ve HPLC-PDA ile miktar analizi yapılmıştır. Elma kabuğunda baskın olarak kuersetin ve glikozitlerinin bulunduğu ve fermantasyon sonucunda konsantrasyonlarında azalma meydana geldiği saptanmıştır. A. aculeatus ZGM6 ve A. japonicus ZGM4 ile fermente edilen elma kabuklarında baskın olan fenolik maddenin taksifolin izomeri olduğu, A. niger ZDM2 ve A. tubingensis ZDM1 ile fermente edilen elmalardaki baskın fenoliklerin ise eriodiktiol ve kateşin izomerleri olduğu görülmüştür. Bu sonuçlara göre, fermente edilmiş elma kabuğunda en yüksek TPC ve antioksidan aktivite artışı gösteren A. niger ZDM2 fermantasyon koşullarının optimizasyon çalışmalarında kullanılmıştır. İlk olarak, fermantasyonda etkili olan faktörleri belirlemek için dokuz faktör (sodyum nitrat, üre, pepton, amonyum klorür, maya ekstraktı, glukoz, sakkaroz, laktoz ve fermantasyon süresi) PBD metodu ile incelenmiştir. PBD ile belirlenen etkili faktörlerin (üre ve laktoz konsantrasyonları ve fermantasyon süresi) optimum seviyeleri CCD ile RSM uygulanarak saptanmıştır. Optimum fermantasyon koşulları, 5,9 g/L üre, 11,5 g/L laktoz ve 198 saat fermantasyon süresi olarak bulunmuştur. Elma kabuğu optimum koşullar uygulanarak fermente edildiğinde TPC ve antioksidan aktivite (DPPH) değerleri sırasıyla 6 ve 10 kat artmıştır. Beşinci bölümde, kestane kabuğu dört izolat kullanılarak fermente edilmiş ve ellajik asit üretimi incelenmiştir. LC-MS/MS ile tanımlanan ellajik asidin konsantrasyonu HPLC-PDA detektörü ile belirlenmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda, en yüksek ellajik asit konsantrasyonu (2,04±0,31 mg ellajik asit/g kuru madde) A. japonicus ZGM4 ile fermente edilmiş kestane kabuklarında bulunmuştur ve bu izolat fermantasyon koşullarının optimizasyonunda kullanılmıştır. Bu amaçla ilk olarak fermantasyon koşullarını belirlemek amacıyla dokuz faktör (sodyum nitrat, üre, pepton, amonyum klorür, maya ekstraktı, glukoz, sakkaroz, laktoz ve fermantasyon süresi) PBD metodu ile incelenmiş ve üretilen ellajik asit miktarı üzerinde etkili olarak bulunan faktörler CCD kullanılarak RSM ile optimize edilmiştir. Laktoz ve maya ekstraktı konsantrasyonları ve fermantasyon süresi fermantasyonda etkili faktörler olarak bulunmuştur. Optimum fermantasyon koşullarında (11,5 g/L laktoz, 5,9 g/L maya ekstraktı ve 140 saat fermantasyon süresi) ellajik asit miktarı 2,72±0,21 mg ellajik asit/g kuru madde olarak bulunmuştur. Optimizasyon çalışmalarıyla, ellajik asit miktarında fermente edilmemiş kestane kabuğunda bulunan ellajik asit miktarına oranla yaklaşık 6 kat artış sağlanmıştır. Tez çalışmasının son bölümünde, fermente edilmiş ve edilmemiş elma ve kestane kabukları yoğurda ilave edilerek, yoğurdun TPC ve antioksidan aktivitesinin arttırılması hedeflenmiştir. Hazırlanan yoğurt örneklerinin TPC ve DPPH aktiviteleri hazırlanmalarının hemen ardından ve 3 gün depolanmadan sonra ölçülmüştür. Sade yoğurdun TPC ve DPPH aktivitesi sırasıyla 98,2 mg GAE/100 kuru madde ve 83,8 TE/100 g kuru madde olarak hesaplanmıştır. Fermente olmayan elma ve kestane kabuğu ekstraktı ile zenginleştirilen yoğurt örneklerinde TPC sırasıyla 2 ve 3 kat artarken, fermente elma ve kestane kabuğu ekstraktı ilave edilen yoğurtlarda ise 6 kat artış sağlanmıştır. En yüksek DPPH aktivitesi fermente kestane kabuğu ekstraktı ilave edilmiş yoğurt örneklerinde saptanırken ve bunu fermente elma kabuğu eklenmiş örnekler takip etmiştir.

Food industry generates high amount of fruit and vegetable by-products which can be highly biodegradable and causing environmental pollution. However, by-products of fruit and vegetables have great amount of nutritional and functional compounds that are not utilized but disposed or used as animal feed. To valorize these by-products some new biotechnological processes can be developed to obtain high-value products like enzymes and bioactive components. Fermentation is one of the most popular technology due to its being cost-effective and environmentally friendly. Especially, fungal fermentation can yield various enzymes and bioactive components. In this thesis, local food sources were evaluated to isolate new Aspergillus spp. and their hydrolytic enzyme production ability was screened for the release of phenolics from plant wastes. For this purpose, different agro-industrial wastes were used as a substrate for fungal fermentation. To enhance the production of phenolics, fermentation conditions were optimized by Plackett-Burman Design (PBD) and then response surface methodology (RSM). Obtained phenolic extracts from fermented wastes were added to enhance the phenolic content and antioxidant activity of a model food. The first part of the thesis is focused on the isolation and identification of Aspergillus section Nigri members from different rotten fruits and vegetables such as carrot, apple, fig, grapes (dry and fresh), corn, apricot (dry and fresh), garlic, onion, and dates. Eight black mold colonies were isolated for molecular and morphological identification. Six different aspergilli were selected from grape and date and named as Aspergillus tubingensis ZDM1 and ZGM5, Aspergillus niger ZDM2 and ZDM3, Aspergillus japonicus ZGM4 and Aspergillus aculeatus ZGM6 according to the ITS sequences. In the second part, selected Aspergillus spp. were screened to determine their ability to produce industrially important hydrolytic enzymes including cellulase, tannase and pectinase using specific carbon sources for each enzyme both on solid and in liquid media. According to the screening results, isolated Aspergillus spp. had the ability to produce cellulase, tannase and pectinase enzymes on plates and also in liquid media. The highest activity of cellulase was obtained by A. japonicus ZGM4 and A. aculeatus ZGM6 as 40 and 35 U/g dry biomass, respectively. All isolates exhibited high level of tannase activity in the range of 150–343 U/g dry biomass after 24 h of incubation. The highest pectinase activity was found to yield at a level of 130 and 117 U/g dry biomass for A. tubingensis ZGM5 and A. aculeatus ZGM6, respectively. These results showed that newly isolated Aspergillus spp. were potential hydrolytic enzyme producers. In the light of these results, four Aspergillus spp. (A. niger ZDM2, A. tubingensis ZDM1, A. japonicus ZGM4 and A. aculeatus ZGM6) were selected from six isolates for further fermentation processes according to the enzymes they secreted. In the third part, the potential of selected agroindustrial by-products including apple peel, apple pomace, pomegranate peel, pomegranate seed, chestnut shell and black carrot pomace were evaluated for determining their potential as natural resources for food components and antioxidants. The gross composition of wastes was determined by applying the methods for protein, reducing sugar, ash, mineral (K, Ca, Mg, Na, Cu, Fe, Mn, Zn), condensed tannin and free glucose. Pomegranate seed contained the highest amount of protein while pomegranate peel and black carrot pomace had the highest amount of minerals among the wastes. Pomegranate peel had the highest amount of reducing sugar, however apple pomace had the highest glucose content. Black carrot pomace had the highest overall mineral content, and pomegranate peel showed the highest level of Ca and K. Chestnut peel was the richest in condensed tannin among the wastes. Soluble and insoluble-bound phenolics and flavonoids in wastes were determined. Total phenolic content (TPC), total flavonoid content (TFC) and antioxidant activity by 2,2-diphenly-1-picrylhydrazyl (DPPH) and cupric reducing antioxidant activity (CUPRAC) assays of wastes were measured. Profile of phenolics were established by RP-HPLC analysis. The highest TPC and antioxidant activity were determined in soluble fraction of pomegranate peel due to significant amount of punicalagin derivatives. Pomegranate peel and seed had the most phenolics and flavonoids in soluble form while other wastes had more than 45% of total phenolics in insoluble-bound form. Chestnut shell showed more antioxidant activity in insoluble-bound fraction compared to that of its soluble fraction. Profile of soluble and bound phenolics of each waste was composed of a wide variety of phenolic compounds. TPC and TFC of wastes were positively correlated with their antioxidant activity. In the fourth part, apple peel was used as a substrate to obtain phenolic compounds by fermentation with Aspergillus spp. due to its higher content of insoluble-bound phenolics compared to that of soluble ones. Fermentation with Aspergillus spp. augmented TPC and antioxidant activity of apple peel. A. niger ZDM2 and A. tubingensis ZDM1 were found to yield the highest level of TPC and TFC. Fermentation with these species increased antioxidant activity of apple peel by 3-4 fold. Phenolics of apple peels were identified by LC-MS/MS and quantified by HPLC-PDA. Quercetin and its glycosides were dominant in unfermented apple peel and their concentrations were reduced by mold fermentation. After fermentation, a tentatively identified isomer of taxifolin was detected in fermented apple peel by A. aculeatus ZGM6 and A. japonicus ZGM4, whereas isomers of eriodictyol and catechin were identified in apple peel fermented by A. niger ZDM2 and A. tubingensis ZDM1. According to the these results, A. niger ZDM2 was chosen for further optimization studies of fermentation conditions to enhance the TPC and antioxidant activity of apple peel. Firstly, nine factors (sodium nitrate, urea, peptone, ammonium chloride, yeast extract, glucose, sucrose, lactose and fermentation time) were screened by Plackett-Burman design (PBD) to determine the fermentation conditions then central composite design (CCD) was performed to determine the level of significant factors. Concentrations of urea and lactose and fermentation time were found significant factors on the production of phenolic compounds from apple peel. Optimum fermentation conditions were 5.9 g/L urea, 11.5 g/L lactose, 198 h of fermentation time. According to the optimization results, TPC and DPPH activity of fermented apple peel was increased 6 and 10 fold, respectively. In the fifth part, the valorization of the chestnut shell (shell: inner pellicle and peel) was performed for the production of ellagic acid by fungal fermentation. Selected four Aspergillus spp. (A. aculeatus ZGM6, A. japonicus ZGM4, A. niger ZDM2, A. tubingensis ZDM1) were used to assess their ellagic acid production capacity. A. japonicus ZGM4, the best producer with the ellagic acid concentration of 2.04±0.31 mg ellagic acid/g dry matter, was used as test microorganism to determine the optimum fermentation conditions. CCD was utilized to optimize three significant factors including concentrations of lactose and yeast extract and fermentation time. The CCD resulted in the production of 2.72±0.21 mg ellagic acid/g dry matter in the optimized medium with 11.5 g/L lactose, 5.9 g/L yeast extract after 140 h of fermentation. Optimized fermentation conditions generated 6-fold increase in yield of ellagic acid in fermented chestnut shell compared to that of unfermented chestnut shell. In the final part, fermented apple peel and chestnut shell phenolic extracts were added into yoghurt as functional ingredients. Yoghurt fortified with unfermented apple peel and chestnut shell extract increased the TPC as 2.2 and 3.1-fold, respectively. On the other hand, yoghurt fortified with fermented apple peel and chestnut shell extract increased the TPC as 5.8 and 6.3-fold compared to the plain yoghurt, respectively. The highest DPPH activity was measured in yoghurt sample with fermented chestnut shell followed by the sample with fermented apple peel and those with unfermented wastes.