Coriolopsis Polyzona Mucl 38443 Suşundaki Cplcc2 Lakkazını Kodlayan Genomik Ve Cdna Dizilerinin İzolasyonu Ve Karakterizasyonu

Abstract

Lignoselüloz, selüloz, hemiselüloz ve lignin polimerlerinden oluşan ve dünya üzerinde en çok bulunan biyokütledir. Odunsu bitkilerin en dış katmanında bulunan ve heterojen yapısı nedeniyle parçalanması çok zor olan lignin, selüloz ve hemiselülozu sararak mikrobiyal depolimerizasyondan korur. Global karbon döngüsünde ve lignoselülozik hammaddelerin kullanıldığı endüstriyel uygulamalarda ligninin biyodegredasyonu çok önem arz eden bir aşamadır. Doğada, ligninin biyodegredasyonunu gerçekleştirebilen bazı özelleşmiş mantar türleri bulunmaktadır. Mantarlar arasında beyaz çürükçül küf mantarları, lignin peroksidaz (LiP), manganez peroksidaz (MnP) ve lakkaz enzimleriyle lignoselülozları parçalayabilmektedir. Peroksidazlar elektron alıcısı olarak H2O2 kullanırken, lakkazlar atmosferik oksijeni elektron alıcısı olarak kullanarak delignifikasyonu gerçekleştirmektedir. Lakkazlar (benzendiol:oksijen oksidoredüktaz; EC 1.10.3.2) çoklu mavi bakır oksidazları (ÇBO) içeren protein süper ailesinin üyeleridir. Bu enzimler moleküler oksijeni elektron alıcısı olarak kullanıp suya indirgeyerek fenolik ve fenolik olmayan lignin içerikli bileşiklerin de oksidasyonunu katalizleyebilmektedir. Bu özellikleri ile endüstriyel atıkların (özellikle kağıt, tekstil ve petrokimya endüstrisi atıkları) detoksifikasyonu, tıbbi tanı çalışmaları, pestisitlerin, herbisitlerin ve topraktan belirli patlayıcıların temizlenmesi, içeceklerin (meyve suyu, şarap, bira) işlenmesi, askorbik asit belirlemesi, şeker pancarı pektininden jel eldesi, fırıncılık, kozmetik ve biyosensör yapımı gibi birçok farklı biyoteknolojik alanda kullanılabilen, endüstriyel öneme sahip enzimlerdir. Şimdiye kadar, bitkilerden ve küflerden pek çok lakkaz izole edilip karakterize edilmesine rağmen hali hazırda biyoteknolojik uygulamalarda çoğunluklar küf kökenli lakkaz enzimleri kulanılmaktadır. Birçok fungus türü, farklı büyüme koşulları ve çevre şartlarında birden fazla lakkaz izoenzimi üretebilmektedir. Aynı suş tarafından üretilen lakkaz izoenzimlerinin biyokimyasal özellikleri ve enzim aktiviteleri birbirinden farklılık göstermektedir. Bu nedenle, yeni bir lakkaz olma potansiyeli barındıran her bir lakkaz izoenziminin izole edilerek fizyolojik ve biyokimyasal özelliklerinin detaylı bir şekilde araştırılması gerekmektedir. Bu çalışmalar, hem lakkazların organizmadaki fizyolojik rollerinin anlaşılmasına katkıda bulunacağı için hem de her biyoteknolojik uygulamaya yönelik en uygun lakkaz enziminin kullanılabilmesine olanak sağlayacağı için önemlidir. Araştırma grubumuz tarafından gerçekleştirilen önceki çalışmada, beyaz çürükçül küf mantarı Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşunda, lakkazların korunmuş bölgelerine özgü dejenere primerler kullanılarak cDNA kütüphanesi oluşturulmuş ve lakkaz izoenzimlerine ait üç farklı kısmi cDNA dizisi, Cplcc1, Cplcc2 ve Cplcc3 olarak tanımlanmıştır. Bu lakkaza özgü cDNA dizileri, National Center for Biotechnology Information (NCBI) veritabanında yapılan BLAST araması sonucunda, önceden tanımlanmış lakkaz kodlayan dizilerle, yaklaşık olarak %80 benzerlik göstermiştir. İleriki çalışma olarak gerçekleştirilen bu mevcut araştırmada ise Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşundaki CpLcc2 lakkazını kodlayan genomik DNA ve tam boyuttaki cDNA'nın izolasyonu ve karakterizasyonu amaçlanmıştır. Cplcc2 kısmi cDNA’sı kalıp alınarak dizayn edilen RACE primerleriyle Coriolopsis polyzona MUCL 38443 total RNA’sı kullanılarak 5’ ve 3’ RACE reaksiyonları gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon ürünleri dizilenerek analizleri gerçekleştirilmiş ve Cplcc2 geninin 5’ ve 3’ uçları elde edilerek gen spesifik primer dizaynı yapılmıştır. Dizayn edilen primerler ile tam boyuttaki Cplcc2 geni ve cDNA’sı izole edilmiş ve karakterize edilmiştir. Tam boyuttaki Cplcc2 cDNAsı, ATG başlama kodonundan TGA bitiş kodonuna kadar, teorik olarak 20 amino asitlik sinyal dizisi taşıyan ve 520 aminoasit kodlayan, 1563 baz çifti içermektedir. Buna göre Cplcc2 cDNA’sı National Center for Biotechnology Information (NCBI) veritabanında yapılan BLAST homoloji araması sonucunda, Trametes türlerine ait lakkaz genleriyle %82 benzerlik göstermiştir. Cplcc2 açık okuma çerçevesinin kodladığı CpLcc2 proteini ise BLAST analizleri yapıldığında Trametes türlerine ait lakkazlar ile %86 benzerlik göstermiştir. Ayrıca yapılan protein BLAST analizleri sonucunda CpLcc2 lakkazının üzerinde, teorik olarak korunmuş T1 bakır bağlanma bölgesi, T2/T3 trinükleer bakır bağlanma bölgeleri gösterilmiştir. CpLcc2 türetilmiş amino asit dizisinden yola çıkılarak, CpLcc2 proteininin teorik moleküler ağırlığı 56.4366 kDa ve teorik izoelektrik noktası (pI) 6.33 olarak hesaplanmıştır. Buna ek olarak, gen spesifik primerlerle Coriolopsis polyzona MUCL 38443 genomik DNA’sından izole edilen Cplcc2 genomik DNA dizisi, 2145 baz çifti uzunluğunda olup, 52 ile 77 baz çifti arasındaki uzunluklarda değişen 10 intron içermektedir. Cplcc2 geninin BLAST analizleri yapıldığında ise Trametes türlerine ait lakkaz genleri ile maksimum %73 benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Cplcc2 genine ait türetilmiş amino asit dizisinin, beş adet potansiyel N-glikolizasyon bölgesine (Asn-X-Thr/Ser) sahip olduğu gösterilmiştir. Lakkaz aktif bölgesinde yer alan ve bakır atomlarının koordinasyonu için büyük önem taşıyan, bir sistein (Cys 474) ve on histidin (His85, His87, His130, His132, His416, His419, His421, His473, His475, His479) kalıntısından oluşan korunmuş bakır ligandları, CpLcc2 türetilmiş amino asit dizisi üzerinde belirlenmiştir. Diğer yandan, T1 bakır bölgesi açısından önemli Cys 474 ile yüksek redoks potansiyeli için esansiyel olan Phe 484 kalıntıları da ayrıca bulunmuştur. Bunlara ek olarak, CpLcc2 lakkazını kodlayan amino asit dizisi beş sistein kalıntısı içermektedir. CpLcc2 enziminin filogenetik analizleri ise MEGA 6.0 yazılımı ile gerçekleştirilmiştir. CpLcc2’ye ait türetilmiş amino asit dizisi, diğer lakkazları kodlayan amino asit dizileriyle MEGA 6.0 yazılımı içerisinde yer alan ClustalW programı kullanılarak hizalanmıştır. GenBank’taki diğer fungus, bakteri, bitki ve böcek lakkazlarıyla kurulan Neighbor joining ağacı ile, CpLcc2 ve Trametes hirsuta lakkazının aynı filogenetik ailede yer aldıkları gösterilmiştir. Sonuç olarak, bu tez kapsamında Coriolopsis polyzona MUCL 38443 suşunda CpLcc2 lakkazını kodlayan cDNA ve gen dizilerinin izolasyonu ve karakterizasyonu başarıyla gerçekleştirilmiştir. Bu lakkaz izoenziminin filogenetik analizleri yapılmış, enzimin teorik molekül ağırlığı ve izoelektrik noktası hesaplanmıştır. Türetilmiş CpLcc2 aminoasit dizisi lakkazlara özgü motifler saptanmış ve CpLcc2 lakkazının yüksek redoks potansiyeline sahip bir lakkaz olduğuna işaret eden amino asit kalıntıları belirlenmiştir.

Laccases (benzenediol:oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) are members of the protein superfamily which includes multicopper oxidases (MCO). These enzymes are able to catalyze the oxidation of phenolic and non-phenolic lignin related compounds. Thanks to these characteristics, laccases have great industrial importance because of their useful applications for several biotechnological processes such as the detoxification of industrial effluents (mostly from the paper, pulp, textile and wastes of petroleum chemical industry), medical diagnosis, bioremediation of pesticides, herbicides and certain explosives in soil, processing of the beverages (wine, fruit juice and beer), determination of ascorbic acid, the gelation of the sugar beet pectin, bakery, cosmetics and construction of biosensors. Previously, three different partial cDNA sequences described as Cplcc1, Cplcc2 and Cplcc3, belonging to laccase isoenzymes were identified from white-rot fungus Coriolopsis polyzona MUCL 38443 strain by our research group. Those laccase-specific cDNA sequences showed around 80% similarity with previously submitted laccase encoding sequences in National Center for Biotechnology Information (NCBI) database using BLAST search. As a further work, the present research aimed at isolation and characterization of the genomic DNA and full-length cDNA, encoding the laccase CpLcc2 from Coriolopsis polyzona MUCL 38443. Principally, the genomic DNA encoding the laccase Cplcc2 was isolated and characterized. The corresponding open reading frame for full length Cplcc2 cDNA from ATG start codon to TGA stop codon is 1563 bp coding for 520 amino acids with a putative 20-residue signal sequence. BLAST homology search results of Cplcc2 cDNA revealed 82% similarity with laccase genes of Trametes species. Cplcc2 open reading frame encodes deduced CpLcc2 protein which gives 86% identity with laccases of Trametes species. Theoretical molecular weight and isoelectric point of CpLcc2 were calculated as 56.4366 kDa and 6.33, respectively. Additionally, the genomic DNA sequence of Cplcc2 is 2145 bp in length and interrupted with 10 introns vary between 52 to 77 base pairs in length. Cplcc2 gene shows maximum 73% identity with laccase genes from Trametes species. The deduced amino acid sequence of CpLcc2 has five potential N-glycosylation sites (Asn-X-Thr/Ser). Conserved copper ligands comprised of one cysteine residue and ten histidine residues were identified in the deduced aminoacid sequence of CpLcc2 that are crucial for the coordination of copper atoms on the active site of laccase. On the other hand, Cys 474 and Phe 484 residues were also found which are important for T1 copper domain and high redox potential of laccases, respectively. Phylogenetic analyses were performed using the MEGA version 6.0 software. Deduced aminoacid sequences of CpLcc2 were aligned using the Clustal W program in MEGA 6.0. Neighbor joining tree which was constructed with other laccases from GenBank, indicated that CpLcc2 and Trametes hirsuta laccase belong to same phylogenetic family.