P60-katanin İn Klonlaması Ve Ekspresyonu

Abstract

Katanin mikrotübülleri parçalayan bir proteindir. 60 ve 80 kDa’luk polipeptidlerden oluşan bu heterodimerik protein, stabil mikrotübülleri parçalayabilmek için ATPye ihtiyaç duyar. Kataninin biyolojik rolüne gelince, bu proteinin mitozda önemlidir. Katanin, mitozda mikrotübüllerin eksi uçlarının bağlı oldukları sentrozomlardan ayrılmasına aracı olmaktadır ve böylece mikrotübüllere bağlanmış olan kromozomların akışı sağlanmaktadır. Mikrotübüllerin sentrozomlardan ayrılması sinir hücrelerinde çok önemlidir. Serbest mikrotübüller uzayan aksonlara taşınmaktadır ve burada akson için gerekli olan fiziksel desteği sağlamaktadırlar. Mikrotübüllerin diğer bir görevi de organellerin taşınmasında sübstrat vazifesi görmektir. Katanin iki alt üniteden oluşmaktadır, onların isimleri moleküler ağırlıklarına göre belirlenmiştir. Kataninin alt ünitelerinin araştırılması bu enzimin aktivitesinin ve rollerinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. p80 ve p60 antikorları bu araştırmalarda kullanılacaktır. Monoklonal antikor poliklonal antikora tercih edilmektedir, çünkü monoklonal antikor neredeyse bitmeyen bir antikor kaynağıdır ve tek bir epitop tanıyabilme özelliğine sahiptir. p60’ın ekspresyonu gerçekleştirilmiş olmasına rağmen, protein çözünmüş halde elde edilememiştir. Bu durum monoklonal antikor üretimini zorlaştırmaktadır. Bu çalışmada küçük (600 kb) özel bir p60-katanin kısmı ekspresyon vektörüne klonlanarak ekspresyonu gerçekleştirildi. Ekspres edilen protein çözünmüş halinde bulunmaktadır. Sonuçta üretilen çözünmüş protein immobilize metal afinite kromatografisi yöntemiyle doğal şartlar altında saflaştırıldı. Bu projenin sonraki aşamalarında da rekombinant p60-katanini kullanılarak monoklonal antikor üretilecektir. Üretilen antikorun p60 katanin inhibisyonu, p60’kataninin ekspresyonunun ve lokalizasyonun in vivo gözlenmesi gibi pek çok geniş kullanım alanı olacaktır. Bu çalışmalar mikrotübüller ve kataninle ilgili hastalıklarının anlaşılabilmesini sağlayacaktır ve hatta belki uzun vadede bu hastalıkların iyileştirilmesinde kullanılacaktır.

Katanin is a microtubule severing protein. This heterodimeric protein (60 and 80kD polypeptides) requires ATP to sever and disassemble stable microtubules. Katanin is important in mitosis, it mediates the disassembly of microtubule minus ends during poleward flux. Release of microtubules from centrosome is also essential in neuronal cells. Released microtubules are transported into growing axons where they provide architectural support and a substrate along which organelles are transported in both directions within the axon. Katanin consists of two subunits: p60 and p80 which were named according to their molecular weight. Studies of katanin’s subunits would enable us to understand activity and roles of katanin better. Antibodies against p80 and p60 will be used in these studies. Monoclonal antibodies are preferred against polyclonal antibodies since they are an almost infinite source of antibodies and recognize one single epitope. However, expression experiments with p60 resulted in an insoluble protein until now and this hinders production of monoclonal antibody. In this study a short specific sequence (600 kb) of p60-katanin was expressed after being cloned into expression vector. Expressed protein is found in the soluble fraction. Finally, soluble protein was purified using metal affinity chromatography under native conditions. The next step will be to produce monoclonal antibody using recombinant p60-katanin. Produced antibody will have wide application area e.g. inhibition of p60 subunit, observation of p60 in vivo expression and localization which will help to understand human disorders related to microtubules and katanin, and maybe eventually even will be even used to treat them.