Candıda Methylıca Format Dehidrogenaz’ın Nad+ / Nadp+ Spesifitesi İçin Kritik Bölgelerin Bölge Saturasyon Mutagenezi

Abstract

Bu çalışmada, Candida methylica format dehidrogenaz enziminin NADP+ koenzimine karşı aktivitesinin arttırılması amacıyla proteinlerin yeniden dizayn edilmesinde kullanılan yönlendirilmiş evrim metodlarından bölge-saturasyon mutagenez yöntemi kullanılmıştır. Koenzim bağlama bölgesinde koenzim spesifitesinden sorumlu bölgeler, Pseudomonas. sp.101 ve Candida boidinii FDH kristal yapılarına dayanarak Insight II (Accelrys) programı ile oluşturulan cmFDH homoloji modeli ile belirlenmiştir. Belirlenen D195, Y196 ve Q197 bölgelerine dejenere primerler ile bölge-saturasyon mutagenezi uygulanmış ve mutant kütüphaneleri oluşturulmuştur. Etkili mutantlar, kolorimetrik taramama metoduyla belirlenmiştir. Taranan yaklaşık 400 koloniden 27 birey NADP+ koenzimine karşı aktivite göstermiştir. Bu sonuçlar, belirlenen bölgelerin NAD(P)+ spesifitesinde önemli bölgeler olduğunu göstermiştir, ayrıca NADP+-spesifik cmFDH geliştirilmesinde umut verici olmuştur.In this project, we used site saturation mutagenesis, which is a technique using a directed evolution approach to redesign of proteins to improve the KM of Candida methylica FDH towards NADP+. In the coenzyme binding domain, the amino acid residues which are responsible for the coenzyme specificity were determined by using Insight II (Accelrys) program on a homology model of cmFDH based on Pseudomonas. sp.101 and Candida boidinii FDH crystal structure. Site saturation mutagenesis with degenerate primers to the determined residues D195, Y196, Q197 was applied and mutant libraries were constructed. The efficient mutants have been screened by using colorimetric screening assay. 27 candidates have shown activity towards NADP+ from nearly 400 screened colonies. These results reveal that, these residues are important in controlling the cofactor specificity of formate dehydrogenases, and promising for developing NADP+-dependent cmFDH enzyme.