Oksidatif Strese Dirençli Mutant Mayanın Karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada evrimsel mühendislik yöntemiyle daha önce elde edilmiş olan oksidatif strese dirençli mutant S. cerevisiae’nin fizyolojik ve moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Fenotip analizi için katı besi yerinde yapılan çapraz direnç testi ile mutantın dirençli ya da duyarlı olduğu stres koşulları belirlenmiştir. Bunun için farklı konsantrasyondaki hidrojen peroksit ve farklı stres faktörü içeren katı besiyerlerinde mayalar üretilmiş ve sonuçları gözlenmiştir. Ayrıca kalsiyum ve glutamik ait içeren hidrojen peroksitli katı besiyerlerinde mayalar büyütülmüş, bu sayede kalsiyumun ve glutamik asidin, oksidatif stres direnci üzerine etkileri gözlenmiştir. Fizyolojik analiz olarak, HPLC (Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografi) ile, üretilen ve tüketilen metabolitler ölçülmüştür. Hem mutant hem yaban tipin farklı üreme koşullarında ve farklı zamanlarda, besi yerindeki glikoz tüketimi, maltoz, etanol, gliserol ve asatet üretimi belirlenmiştir. Ayrıca, enzimatik yöntemlerle hücrede oluşturulan trehaloz ve glikojen konsantrasyonları ölçülmüştür. Fizyolojik analizlerin yanında gen delesyonu ile hem yaban bireyde, hem de mutant bireyde YAP1 geni silinmiş mutant suşlar elde edilmiş ve bu suşlar da farklı konsantrasyona sahip katı besiyerinde üretilerek bu genin üreme ve stres üzerindeki etkisi gözlemlenmiştir. Moleküler analiz kapsamında qPCR (quantitative PCR) ve mikroarray yapılmıştır. Yaban tipin ve mutantın, hem stresli koşulda hem de kontrol koşulunda OCA1, MSN2 ve MSN4 genlerinin ekspresyon düzeyleri belirlenip karşılaştırılmıştır. Daha kapsamlı gen ekspresyon analizi olarak mikroarray yapılmıştır. Yaban tip ve mutantın tüm gene ekspresyon düzeyleri karşılaştırılmıştır. Mutantta ekspresyonu artan ve azalan genler belirlenmiş.In our study, S. cerevisiae was used as a model organism. Oxidative stress resistant mutant S. cerevisiae had been obtained previously by evolutionary engineering method was chracterized. To understand resistance mechanism, this resistant mutant was used. Phenotypical experiments were carried out to observe its resistance and sensitivity to different stress factors. Furthermore, effects of calcium and glutamic acid on oxidative stress tolerance were investigated for wild type and oxidative-stress resistant mutant. Glucose, maltose, glycerol, ethanol and acetate amounts were measured by HPLC and, trehalose and glycogen amounts were determined via enzymatic analysis. Physiology of oxidative stress resistant mutant was observed via these studies. Glucose utilization, maltose, glycerol, ethanol and acetate production results were reported. The results gave information about differences in metabolite levels and described generally the metabolism of H2O2 stress resistant mutant. In addition, deletion of YAP1 gene, in the mutant gave on the potential role of this gene in H2O2 resistance mechanism, of the mutant. For gene expression analysis, qPCR was carried out. Expression of some genes which have been desired in the literature to be potentially important in oxidative stress was investigated. OCA1, MSN2 and MSN4 expression levels were analyzed by qPCR. For a detailed and global investigation of gene expression, microarray analysis was carried out. Gene expression levels were determined for both wild type and oxidative-stress resistant mutant, and compared to each other. Up-regulated and down-regulated genes were determined and their pathways were investigated.