Production And Characterization Of Chitosan-hydroxyapatite-fibrinogen 3d Scaffolds By Different Techniques

Abstract

Çeşitli sebeplerle ortaya çıkan kazalar ve hastalıklar sonucu insanlar doku ve organ kaybı yaşamaktadırlar. Bu tür hasarların tedavisi için de organ nakli gibi zor ve zahmetli yöntemler gerekebilmektedir. Fakat gelişen teknoloji ve yaşam bilimleri sayesinde yapay doku ve organ üretimi için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin en başında da yapı iskeleleri gelmektedir. Yapı iskelelerinin üretimde farklı biyomalzemeler kullanılmaktadır. Malzeme seçimi yapı iskelesinin nerede ve hangi amaçla kullanılacağına bağlı olarak değişir. Fakat polimer malzemeler, hem kolay üretilebilmesi hem de üretim çeşitlerinin çokluğu, malzemenin kolay şekil alabilmesi gibi özelliklerinden dolayı doku mühendisliği alanında oldukça fazla tercih edilmektedir. Kitosan, biyomalzeme olarak doku mühendisliği alanında oldukça sık kullanılan lineer, doğal bir polisakkarittir. Yine doğal bir polisakkarit olan kitinin deasetilasyonu sonucu, N-asetil-D-glikozamin ve D-glikozamin monomerlerinden oluşur. Kitosanın bu kadar çok kullanılmasının sebebi; biyouyumlu, biyobozunur, toksik olmayan, antitümör, antimikrobiyal ve yara iyileşitirici olmasıdır. Moleküler içeriğine ve Ca/P molar oranına göre kalsiyum fosfat bileşikleri farklı alanlarda kullanılabilirler. Hidroksiapatit ise 1,67 Ca/P oranına ve Ca10(PO4)6OH2 formülüne sahip, omurgalı canlılardaki sert dokuların temel bileşenlerinden biridir. Kemik gibi bulunduğu yapılara sert bir karakteri kazandırır. Deneyler boyunca kullanılan hidroksiapatit, 850°C’de 4 saat boyunca kalsine edilen sığır kemiğinden elde edilmiştir. Fibrinojen ise kanda ve hücre dışı sıvıda bulunan çözülebilir bir proteindir. Bu proteinin en büyük özelliği kanama başladığı zaman fiberler oluşturarak kanın pıhtılaşmasında rol almasıdır. Kanın pıhtılaşma mekanizmasının yanı sıra, hücreler arası ve hücre-doku arası etkileşimler, inflomatuar cevap, yara iyileşmesi, yeni doku oluşumu gibi görevleri de üstlenmektedir. Protein, iki tane dışta D ve bir tane merkezde E domaininden oluşmaktadır. Bu domainler birbirlerine Aα, Bβ ve γ polipeptidleri ile bağlanmaktadır. Bu çalışmanın amacı sert doku uygulamalarında kullanılabilecek yapı iskelelerini film üretiminin yanı sıra liyofilizasyon ve elektroeğirme yöntemleri ile üretmektir. Bu amaç doğrultusunda farklı bileşimlerde kitosan-hidroksiapatit ve kitosan-hidroksiapatit-fibrinojen bileşimli numuneler üretilmiştir. Çalışmada yapı iskelesi üretimi için üç farklı yöntem kullanılmıştır. Bunlardan birincisi film dökmedir, %2 (h/h) asidik asit içerisinde oluşturulan ve daha sonra NaOH ile pH’ı 7,4’e ayarlanan polimer çözeltisinin bir petri kabına dökülmesi ve oda sıcaklığında kurutulması sonucunda polimer filmler elde edilmiştir. Bir diğer yöntem olarak da liyofilizasyondan faydalanılmıştır. Liyofilizasyon yönteminin temel prensibi, suyun dondurulması sonucu oluşan buz kristallerinin süblimleştirilmesi sonucu malzemeyi kurutmaktır. Bu yöntemin genel kullanım amacı gıdaların ve çabuk bozulabilecek organik malzemelerin daha uzun süre saklanmasını sağlamak olsa da doku mühendisliğinde de por oluşturmak amaçlı da oldukça fazla kullanılan bir yöntemdir. Bu amaçla %2 (h/h) astik asit içerisinde oluşturulan ve daha sonra NaOH ile pH’ı 7,4’e ayarlanan polimer çözeltisi hazırlanmıştır. Hazırlanan çözeltiler -20°C’de 24 saat boyunca dondurulmuş ve daha sonra 6 gün boyunca liyofilize edilmiştir. Son üretim yöntemi olan elektroeğirmede ise amaç polimer çözeltisine yüksek voltaj uygulayıp toplayıcı plaka ile iğne ucu arasında oluşacak manyetik alan sayesinde polimer solüsyonun saçılarak fiber oluşturmasını sağlamaktır. Burada üretim sistemine etki eden bir çok parametre vardır. Bunların başlıcaları; voltaj değeri, pompalama hızı ve toplayıcı plakanın uzaklığıdır. Kitosan-hidroksiapatit esaslı malzemelerin elektroeğirme yöntemi ile üretilmesi içinse çözücü olarak saf halde trifloraasetik asit kullanılmıştır. Kitosanın bu çözücü içinde çözünmesinin ardından eklenen hidroksiapatit ile süspansiyon hazırlanmış ve 17 kV voltaja maruz bırakılmıştır. Bu işlem sırasında polimer çözeltisinin pompalama hızı 0,4 ml/s ve iğne ucu işle toplayıcı plaka arasındaki mesafe de 10 cm olarak belirlenmiştir. Üretim sonucunda faz analizi, moleküler bağ karakterizasyonu ve mikroyapı karakterizasyonu uygulanmıştır. Faz analizi ile birlikte amorf yapıda olan kitosan ve fibrinojen, hidroksiapatit ile liyofilizasyon ve film üretimi sonucu kristalize bir yapı kazandığı gözlenmiştir. 10-80° 2θ değerleri arasında 2°/dk hız ile yapılan faz analizi sonucu saf hidroksiapatitin 9-0432 kart numaralı hidroksiapatit olduğu sonucu elde edilmiştir. Aynı zamanda saf hidroksiapatit tozlarına uygulanan XRD sonrasında β-TCP’ye ait pikler gözlenmemiştir. Bu da üretilen hidroksiapatitin biyolojik olarak türetildiğinin bir başka göstergesidir. Film ve liyofilizasyon ile üretilen yapı iskelelerindeki piklerin de yine hidroksiapatite ait karakteristik pikler olduğu gözlenmiştir. Yapılan işlemler sırasında kitosan kristal bir yapı göstermemiştir. Fakat kitosan miktarı arttıkça pik şiddetleri düşmüştür. Bunun yanında elektroeğirme sonucunda malzeme amorf yapısını korumuştur. Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonucunda liyofilizasyon ile porlu, üç boyutlu ve elektroeğirme ile nanolif yapıda yapı iskeleleri başarıyla üretildiği görülmüştür. Moleküler bağ karakterizasyonu ilk olarak başlangıç tozlarına yapılmıştır. Yapılan analizler sonucunda tozların saf olduğu anlaşılmıştır. Üretilen film ve yapı iskelelerine yapılan moleküler bağ karakterizasyonu sonucu 3000-3500 cm-1 civarında –OH ve –CH3 fonksiyonel gruplarına ait bantlar gözlenirken, 1027 cm-1’de de PO4-3 fonksiyonel gurubuna ait pikler göze çarpmıştır. 1600-1500 cm-1 aralığında da amit I, amit II ve amit III fonksiyonel gruplarının varlığı tespit edilmiştir. Bu gruplar hem fibrinojenden hem de kitosandan kaynaklıdır. Üretilen filmlerin ve doku iskelelerinin mikroyapıları taramalı elektron mikroskopu ile incelenmiştir. Polimer filmlerin yüzey morfolojsi incelendiğinde hidroksiapatit ilavesi ile birlikte yüzeyin porlu bir yapı kazandığı gözlenmiştir. Fakat fibrinojen ilavesi ile bu porlu yapı ortadan kalkmış ve yeni oluşan moleküler etkileşimlerin yardımıyla oldukça porsuz bir yüzey morfolojisi gözlenmiştir. Tüm bunların yanında yüzeyde hidroksiapatit tanecikleri de gözlenmiştir. Amaçlandığı gibi liyofilizasyon sonucu porlu, elektroeğirme sonucu da fiber yapı başarıyla elde edilmiştir. Liyofilizasyon üretimi ile porların yapısı hidroksiapatit miktarının artması ile değişmiştir. Ayrıca fibrinojen ilavesi de por boyutunun büyümesini sağlamıştır. Nanolif yapısı da hidroksiapatit katkısıyla incelmiştir. Su hapsetme özelliği olan kitosanın bu karakteri fibrinojen ilavesi ile arttırılmıştır fakat hidroksiapatit katkısının nasıl bir etkisi olduğu incelenmemiştir. Bunun yanında üretim yöntemi de su hapsetme özelliğine belirgin bir avantaj ya da dezavantaj sağlamamıştır. Sonuç olarak sert doku uygulamalarında kullanılacak olan kitosan-fibrinojen-hidroksiapatit bileşimli yapı iskelesi üretimi başarıyla sonuçlanmış ve sonrasında yapılan karakterizasyon çalışmalarıyla örneklerin özellikleri incelenmiştir. Beklenildiği üzere film üretimi ile porsuz, tamamen katı bir yapı elde edilirken, liyofilizasyon ile porlu, elektroeğirme ile de lifli yapılar elde edilmiştir. Üretim teknikleri kıyaslandığında ise kristalizasyon ve moleküler bağ karakterizasyonu açısından film ve liyofilizasyon üretimi ile ilgili belirgin bir fark yokken elektroeğirmede faz analizi sonuçları hidroksikarbona apatit piklerine rastlanmamıştır.

People may have tissue or organ loss as a result of accidents or diseases. Difficult and troublesome processes, such as organ transplantation, may be required for the treatment of such damages. However, different techniques have been developed to produce artificial tissues and organs through the advanced technology and life sciences. One of the main techniques to develop these artificial body parts is scaffold production. Not only the technique, but also choosing of the true material, which depends on the structure and location of the tissue is an important step for production of scaffolds. Although ceramics, metals and composites are used a lot as biomaterials, polymer materials are preferred due to the properties such as easy to produce, variable techniques of production, easy to shape. Chitosan, a linear polysaccharide, is widely used as biomaterials. The chitosan is formed by copolymerization of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucosamine. The main reasons of the having a widely application range of chitosan are biocombability, biodegradable, anti-toxic, anti-tumor, anti-microbial and wound healing properties. Hydroxyapatite, Ca10(PO4)OH2, is the key inorganic compound of the hard tissue of vertebra. The hydroxyapatite powder for experiments was obtained from bovine bone by calcination at 850°C for 4 hours. Fibrinogen is a protein, which is responsible for blood coagulation, cell-cell and cell-tissue interactions, inflammatory response and wound healing. The aim of this study is production of scaffolds by lyophilization and electrospinning techniques besides polymer films for using in hard tissue applications. On this purpose, the specimens, which contain chitosan-hydroxyapatite and chitosan-hydroxyapatite-fibrinogen compounds in different concentrations were produced. After the fabrication of the scaffolds, phase, molecular bond characterization and microstructure characterization were conducted. According to XRD patterns, the polymer films and lyophilized scaffolds have crystal structure because of hydroxyapatite. The peaks match the pure hydroxyapatite XRD pattern. Moreover, the interactions between hydroxyapatite, chitosan and fibrinogen were determined by molecular bond characterization tests. The specific peak at 1010 cm-1 show the hydroxyapatite presence. The peaks around 1500-1600 and 3000-3500 cm-1 show that the interactions between chitosan, hydroxyapatite and fibrinogen. Another characterized property of the productions was microstructure. The porous structure of lyophilized productions and nanofibers structure of electrospinning productions was observed after microstructure characterization, which is very important to cell proliferation by obtaining larger area and nutrient flow. The absorption of water, which is already a property of chitosan, was improved by addition of fibrinogen. In conclusion, three-dimensional scaffolds, containing chitosan, hydroxyapatite and fibrinogen and being used in hard tissue applications, were produced successfully and the interactions between materials were conducted by characterization tests. The SEM images show that the microstructure of the scaffolds, which are produced by , is damaged by increasing of HA concentration. On the other hand, molecular interactions between materials present except chancing the intensity of the bands due to the change of the concentrations. The swelling ratios of the products did not chance because of the production technique, but did increase due to the addition of fibrinogen.