Kemik Doku Rejenerasyonu İçin Elektroaktif-biyoaktif Biyomalzeme Olarak P3ana/pcl Nanofiberleri: Sentez, Karakterizasyon Ve Hücre Çalışmaları

Abstract

Doku mühendisliği, organa özgün hücrelerin bir iskelet yapı üzerinde çoğaltılması ile yapay doku ve organların üretilmesini sağlamaktadır. Doku mühendisliğinde kullanılan iskelet, doğal hücredışı matrisi taklit ederek, hücrelere geçici olarak destek sağlayan üç boyutlu bir taslak olarak görev almaktadır. Hücreler, iskelet üzerinde çoğalır, göç eder ve özgün hücrelere farklılaşırlar. Kullanılan iskelet, hücrelere gerekli olan kimyasal, morfolojik ve yapısal sinyaller iletmektedir. Bu nedenle, istenilen şekil, boyut ve işleve sahip dokunun oluşturulması amacıyla iskelet seçimi oldukça önemlidir. İskelet tasarımında biyouyumluluk ve porozite gibi çeşitli özelliklerin gözönünde bulundurulması gereklidir. Porlu yapıları ve geniş yüzey alanına sahip olmalarından dolayı nanofiberler doku mühendisliği iskeleti olarak ideal yapılardır. Nanofiber, boyutları ve fibrilli yapıları dolayısıyla doğal hücredışı matrise benzerlik göstermektedir. Elektrospin yöntemi ile sentetik veya doğal polimerler kullanılarak, doku mühendisliği iskeleti olarak kullanılmak üzere nanofiberler üretilmektedir. Polimerik malzemeler arasında, poli(ε- kaprolakton) (PCL) ve PCL içeren kopilimer veya karışımlar doku mühendislik çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır. PCL nanofiberleri biyobozunur, biyouyumludur ve özellikler kemik doku mühendisliği çalışmalarına uygun mekanik özelliklere sahiptir. Nanofiberlerin morfolojik özelliklerine rağmen, hücre ve nanofiber arasındaki etkileşimin arttırılması ve doku yenilenmesinin uyarılması amacıyla, hücrelerin fiziksel veya kimyasal faktörlerle uyarılması gerekmektedir. Nanofiberler, büyüme faktörlerinin nanofiber yüzeyinde bulunan fonksiyonel gruplara kovalent olarak immobilizasyonu ile kimyasal olarak modifiye edilebilirler. Fiziksel uyaran olarak ise, özellikle kemik dokusunu uyarmak üzere elektriksel uyarı kullanılabilir. Hem fiziksel hem de kimyasal uyarıların doku mühendisliğinde kullanılabilmesi için uygun bir iskelet malzemenin seçilmesi gerekmektedir. Bu doğrultuda iletken polimerin kullanımı uygun bir alternatif sağlamaktadır. Son yıllarda iletken polimerlerin doku mühendislik uygulamalarında kullanımı ilgi çekmektedir. Polianilin ve türevleri, biyouyumlu ve elektrokimyasal özellikleri tanımlanmış iletken polimerlerdir. Ancak, polianilin ve türevleri çeşitli çözücüler içerisindeki çözünürlüğünün sınırlı olması nedeniyle sınırlı işlenebilirliğe sahiptirler. Bu sorunun aşılması amacıyla anilin monomeri çeşitli fonksiyonel grupların monomere eklenmesi ile modifiye edilmektedir. Poli(m-antranilik asid) (P3ANA), anilin monomerine karboksil (-COOH) grubu eklemesi ile elde edilmiş bir polianilin türevidir. P3ANA yapısına eklenen karboksil grubu, polimerin sulu ve sulu olmayan çözücüler içerisinde çözünmesi sağlamaktadır. P3ANA, iyi tanımlanmış elektrokimyasal özellikleri, yapısında bulunan fonksiyonel grupların varlığı bakımından hem elektriksel uyarıların hücrelere iletilmesi hem de nanofiberlerin biyomoleküller ile kovalent olarak modifiye edilemesi için uygun bir iletken polimerdir. Hücrelere kimyasal ve fiziksel biyoaktif sinyaller ileten bir elektoaktif ve biyoaktif nanofiber hücre iskeleti üretilmiştir. Poli(ε-kaprolakton)/poli(m-antranilik asit) (PCL/P3ANA) nanofiberleri, PCL çözeltisine artan miktarda P3ANA ilave edilmesinin ardından elektrospin yöntemi ile elde edilmiştir. Fiber yapısına artan miktarda P3ANA eklenmesi, daha küçük fiber çapına, daha fazla yüzey pürüzlülüğüne ve yüzey alanına sahip nanofiberlerin üretilmesini sağlamıştır. PCL/P3ANA nanofiberlerinin geniş yüzey alanına sahip olması, nanofiberlerin büyüme faktörleri ile biyoişlevsel hale getirilmesi için daha fazla uygun bölge ve karboksil grubu sağlamaktadır. Nanofiber yapısına artan miktarda P3ANA ilave edilmesi, nanofiberlerin yapısal özelliklerinin değişmesine neden olarak nanofiberlerin mekanik özelliklerini iyileşmesine neden olmuştur. Elektrokimyasal empedans spektroskopik (EIS) ölçümler, PCL/P3ANA nanofiberlerinde bulunan P3ANA miktarının artmasıyla birlikte, oluşan nanofiberlerin yük transfer direncinin düştüğünü ve daha yüksek iletkenliğe sahip nanofiberlerin elde edildiğini göstermiştir. Bu yüksek elektroaktivite hücrelere elektriksel sinyallerin iletilmesi bakımından avantaj sağlamaktadır. Bu sepeble, yapısında en fazla miktarda P3ANA içeren PCL/P3ANA nanofiberlerinin en fazla yüzey alanına, en iyi mekanik ve elektokimyasal özelliğe sahip olmasından dolayı, bu nanofiberler büyüme faktörleri ile işlevsel hale getirilmiş ve hücrelerin elektriksel olarak uyarılması çalışmalarında kullanılmıştır. Proteinlerin, PCL/P3ANA nanofiber hücre iskeletine kovalent olarak bağlanması sonucu biyoişlevsel hale getirilmesi 1-etil-3-(dimetil-aminopropil) karbodiimid hidroklorid (EDC) and N-hidroksisuksinimid (NHS) aktivayonu işlemi ile gerçekleştirilmiştir. Nanofiber yapısında bulunan karboksil gruplarının aktivasyon verimi, değişen EDC/NHS konsatrasyonuna bağlı olarak spektroskopik ve morfolojik olarak incelenmiştir. Elektrokimyasal empedans spektroskopik ölçümler, karboksil gruplarının aktivasyon derecesine bağlı olarak nanofiberlere kovalent bağlanan protein miktarının değiştiğini göstermiştir. Aktivasyon süreci detaylı olarak incelenmiş ve 50/50 mM EDC/NHS konsantrasyonunun nanofiberleri en etkili şekilde aktive eden konsatrasyon olduğu bulunmuştur. Elde edilen nanofiberler arasından hücre kültür çalışmalarında kullanılmak üzere uygun nanofiberlerin seçilmesinden ve kovalent protein immobilizasyonu için en etkili EDC/NHS konsatrasyonun belirlenmesinin ardından, PCL/P3ANA nanofiber hücre iskeleti, in vitro hücre kültür çalışmalarında kullanılmak üzere kemik morfogenetik protein-2 (BMP-2) ve RGD peptid büyüme faktörleri ile biyoişlevsel hale getilmiştir. BMP, kemik oluşumunu destekleyen güçlü bir osteoindüktif faktördür. BMP varlığı, mezenkimal kök hücrelerin alkalin fosfataz aktivitesinin artışına neden olarak osteoblastik fenotipe yönelimini uyarmaktadır. RGD peptid ise birincil kemik hücre cevabını arttırmak üzere bir adezyon peptidi olarak nanofiber yapısına dahil edilmiştir. RGD peptid, mezenkimal kök hücrelerin osteoblastik farklılaşmasını sağlar ve hücre çoğalmasını arttırır. Hücre ve nanofiber iskelet arasındaki etkileşimini arttırarak, hücrelerin nanofiber üzerinde yayılmasını sağlamaktadır. Nanofiberlere bağlanan BMP-2 ve RGD peptid miktarı bikinkoninik acit (BCA) protein deneyi ve Enerji-Dağılımlı X-ray Spektroskopisi (EDX) ile N atomlarının elemental analizleri sonucu belirlenmiştir. Temas açısı deneyleri sonucunda, yüzeye protein bağlanmasının ardından hidrofobik özellik gösteren nanofiber yüzeyinin hidrofilik özellik kazandığı görülmüştür. EIS ölçümleri, nanofiberlere bağlanan proteinlerin nanofiber çift tabaka kapasitansı ve yük transfer direncinin artmasına neden olduğunu göstermiştir. Nanofiberler, Saos-2 hücreleri üzerinde toksik etki göstermemiş ve hücrelerinin tutunma ve büyüme özelliklerini desteklemiştir. En fazla hücre çoğalması RGD peptid immobilize edilen nanofiberler üzerinde gözlenmiştir. Hücre canlılığının, hücrelerin adhezyonu ve nanofiberin yapısal özellikleri ile ilişkili olduğu görülmüştür. PCL, PCL/P3ANA ve PCL/P3ANA-RGD nanofiberleri üzerinde büyütülen hücrelerin morfolojileri birbirine benzerlik göstermiş ve poligonal şekil sergilemiştir. BMP-2 ile işlevsel hale getirilen nanofiber üzerinde büyütülen hücreler osteosit benzeri morfoloji göstermiştir. Cam lamel, PCL, PCL/P3ANA, BMP-2/PCL/P3ANA ve PCL/P3ANA-RGD nanofiberleri üzerinde büyütülen Saos-2 hücrelerinin alkalin fosfataz (ALP) aktivetisi ve kalsiyum birikimi incelenmiştir. BMP-2 immobilize edilmiş nanofiberler üzerinde büyütülen hücreler, diğer nanofiber ve cam lamel üzerinde büyütülen hücrelere kıyasla en fazla ALP aktivitesi ve kalsiyum birikimine sahip olarak, en yüksek osteogenez derecesine sahip olmuştur. Elektriksel uyarının kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin kemik hücresine farklılaşmasına etkisi ve PCL/P3ANA nanofiberlerinin elektriksel sinyalleri hücrelere iletimi incelenmiştir. Hücrelerin elektriksel olarak uyarılması amacıyla, 0.5 kHz, 1 kHz, 5 kHz ve 10 kHz frekansta; 200 mV/mm, 400 mV/mm and 800 mV/mm elektrik alan (birim mesafede uygulanan voltaj) uygulanmıştır. En yüksek hücre canlılığı 1 kHz frekans uygulanması ile elde edilmiştir. 0.5 kHz ve 1 kHz frekansta en yüksek hücre canlılığı ise hücrelere 400 mV/mm elektrik alan uygulandığında gözlenmiştir. 800 mV/mm elektrik alan uygulandığında ise uygulanan frekanstan bağımsız olarak hücre canlılığı % 50 oranında düşmüştür. Yüksek frekans (5 kHz ve 10 kHz) hücre canlılık değerlerinin belirgin bir şekilde düşmesine neden olmuştur. Elektriksel uyarı varlığında PCL/P3ANA nanofiberleri üzerinde büyütülen hücreler, nanofiberler üzerine yayılarak çoğalmışlardır. 200 mV/mm ve 400 mV/mm voltaj uygulandığında kök hücreler, adherent hücrelerin sahip olduğu aktin uzantılarıyla birlikte osteosit benzeri morfoloji göstermişlerdir. Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin osteojenik farklılaşmasını incelemek adına, hücreler ALP aktivetesi ve kalsiyum birikiminin gösterilmesi için boyanmıştır. Hücreler, çoğalma testinde görülen eğilime uygun olarak ALP aktivitesi ve kalsiyum birikimine sahip olmuştur. 800 mV/mm voltaj uygulanan hücreler ALP aktivitesi ve mineralizasyon göstermemiştir. Hücrelerin düşük osteogenez derecesinin, yüksek voltaj uygulanması ile hücre canlılığının azalması ile ilişkili olduğu görülmüştür. En fazla kalsiyum birikimi ve ALP aktivitesi hücreler 1 kHz frekansta 400 mV/mm voltaj ile uyarıldıklarında görülmüştür. Hücrelerin elektriksel uyarıya verdikleri cevabın incelenmesi ile, nanofiber yapısında bulunan P3ANA polimerinin, nanofiberler üzerindeki kemik iliği mezenkimal kök hücrelerine elektriksel sinyalleri iletebildiği gösterilmiştir.

An electroactive and bioactive nanofiber scaffold which serves both chemical and physical bioactive signals for cells, was fabricated. Electrospun poly(ε-caprolactone)/poly(m-anthranilic acid) (PCL/P3ANA) nanofibers were fabricated by addition of increasing amounts of P3ANA to the PCL solutions. The addition of P3ANA in higher amount resulted a decrease in fiber diameter and high surface roughness and large surface area. The increased surface area of PCL/P3ANA nanofibers serves more available sites and carboxyl groups for biofunctionalization with growth factors. The mechanical properties of PCL/P3ANA nanofibers changed due to P3ANA amount which changed the structural properties of the nanofibers. Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) measurements showed that the increase of P3ANA amount in the PCL/P3ANA nanofibers resulted lower charge transfer resistance values which indicates higher conductivity. Higher electroactivity is advantageous in terms of delivering electrical signals to cells. Therefore the PCL/P3ANA nanofiber scaffold containing the highest amount of P3ANA with highest surface area, best mechanical and electrochamical properties was chosen for biofunctionalization and electrical stimulation of cells. PCL/P3ANA nanofiber scaffold was biofunctionalized with covalent protein attachment by using 1-ethyl-3-(dimethyl-aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) activation process. The activation process was investigated and it was found that 50/50 mM of EDC/NHS was the most effective concentration for the activation of PCL/P3ANA nanofibers. After determination of the suitable nanofiber mat for cell culture studies and the optimum concentrations of EDC/NHS for covalent immobilization, PCL/P3ANA nanofiber scaffold was biofunctionalized with growth factors of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and RGD peptide for in vitro cells studies. The amounts of covalently immobilized BMP-2 and RGD peptide were determined by bicinchoninic acid (BCA) protein assay and with elemental analyzes of N atoms by Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy (EDX). Contact angle measurements showed the changes of the surface properties from hydrophobic to hydrophilic after protein immobilization. The increase in the double layer capacitance and charge transfer values of nanofibers after protein immobilization was showed with EIS. Nanofibers were nontoxic and enable for attachment and growth of Saos-2 cells. The cell proliferation was the highest for the RGD peptide immobilized nanofibers. Cell viability is in correlation with cellular adhesion and structure of the scaffold. Cell morphology was polygonal in shape on the PCL, PCL/P3ANA and PCL/P3ANA-RGD nanofibers is similar to each other. The cells on BMP-2 functionalized nanofibers exhibited osteocyte-like morphology. Alkaline phosphatase (ALP) activity and calcium deposition of Saos-2 cells cultured on cover glass, PCL, PCL/P3ANA, BMP-2/PCL/P3ANA and PCL/P3ANA-RGD nanofibers were investigated. The cells on BMP-2 immobilized nanofibers had the highest ALP activity and the highest amount of calcium deposits among all nanofibers and cover glass, which indicates a higher degree of osteogenesis. The effects of electrical stimulation on the differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells (BMSCs) into bone feature and the ability of PCL/P3ANA nanofibers to deliver the electrical signals to the cell were investigated. Electrical stimulation was applied to the cells with the electric field (voltage difference per unit distance) of 200 mV/mm, 400 mV/mm and 800 mV/mm at frequency of 0.5 kHz, 1 kHz, 5 kHz and 10 kHz. The viability of cells was the highest when frequency of 1 kHz was applied. At frequency of 0.5 kHz and 1 kHz, the highest viability was observed when cells stimulated with 400 mV/mm. When 800 mV/mm AC voltage at any frequency was applied, cell viability was below 50%. The higher frequencies (5 kHz and 10 kHz) caused a dramatic decrease in cell viability. The cells cultured on the PCL/P3ANA nanofibers under electrical stimulation, proliferated by spreading on the nanofiber mats. At 200 mV/mm and 400 mV/mm voltages BMSCs showed osteocyte-like morphology with adherent-cell type actin extensions. Osteogenic differentiation of BMSCs was investigated by staining for ALP activity and Ca deposits. ALP activity and Ca deposition data exhibited similar trend to the proliferation results. The cells stimulated with voltage of 800 mV/mm exhibited almost no ALP activity or mineralization. The highest mineralization and ALP activity was observed when BMSCs stimulated with 400 mV/mm at 1 kHz. The electrical stimulation data suggested that P3ANA in the nanofiber structure was capable of delivering, interacting and mediating the electrical signaling process within the seeded BMSCs.