Bacıllus Stearothermophilus’tan İzole Edilen Nad+ Bağımlı L- Ldh Enzimine Protein Mühendisliğinin Uygulamaları

Abstract

Bacillus stearothermophilus’ tan izole edilen NAD+ bağımlı L - LDH enzimi saf kiral hidroksi bileşiklerin üretilmesindeki endüstriyel potansiyelinden dolayı katalitik ve yapısal özellikleri açısından yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Kiral alfa hidroksi asitlerin şimdiki endüstrideki üretimi 10 ton olup, 0.1 M dan daha fazla miktarda substrat (piruvat) kullanımını sağlayabilecek herhangi bir gelişme endüstriyel açıdan oldukça karlı olacaktır. Pirüvatın laktata dönüşümündeki reaksiyon, oxo-asit substratın, karbonil grubunun koenzim olarak kullanılan NADH’ ten alınan hidrojen iyonu ile indirgenmesi şeklinde gerçekleşir. LDH’lerin dezavantajları substrat olarak kullanılan pirüvatın aşırı konsantrasyonunda inhibe olması ve geniş bir substrat spesifikliğinin olmayışıdır. LDH’ın endüstriyel kullanımını kısıtlayan bu dezavantajlarının uzaklaştırılmasında protein mühendisliği umut verici bir uygulamadır. Proje süresince, istenilen özelliklerdeki LDH’i üretmek için bölgeye özel mutasyon ve DNA suffling olmak üzere 2 farklı strateji uygulandı.

The NAD+-dependent lactate dehydrogenase (LDH) enzyme from Bacillus stearothermophilus has been the subject of intensive research of its structure and catalytic properties. This has been prompted by its industrial potential in the production of chirally pure hydroxyl compounds. The production of chiral (S) α-hydroxyacids is now at the 10-ton scale in industry and any development facilitating the reduction of pyruvate at concentrations greater than 0.1 M would be profitable. The reaction in the pyruvate to lactate direction is achieved by reducing a carbonyl group of the oxo-acid substrate with a hydride ion donated by NADH (used as a coenzyme) and a proton from the protein. The disadvantages of LDHs are their inhibition of by excess substrate (pyruvate) and also not having very broad substrate specificity. In order to make LDH more suitable enzyme for its industrial applications, protein engineering is a promising approach. Two routes are used in this project to produce LDH enzyme with the desired properties. These are site directed mutagenesis and DNA shuffling.