FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı

Bu topluluk için Kalıcı Uri

http://hdl.handle.net/11527/180
Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı altında bir lisansüstü programı olup, yüksek lisans ve doktora düzeyinde eğitim vermektedir.

Gözat

Konu "35S" ile FBE- Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı'a göz atma
  • Öge
    Tek Boya Kullanarak P35s, Tnos Ve Pfmv Hedefli Çoklu Pzr
    (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013-10-01) Tan, Deniz Gülbin ; Dinler Doğanay, Gizem ; 10016919 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and Genetics
    Genetik mühendisliği teknikleri ile modifiye edilen veya üretilen besin bitkileri geleneksel olarak genetiği değiştirilmiş (GD) bitkiler veya genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) olarak isimlendirilir. Genetiği değiştirilmiş bitkilerin ekim alanları 1996 yılından 2012 yılına 100 kat artarak, GD bitkileri yakın tarihimizin en hızlı uyum sağlanan ürün teknolojisi haline getirmiştir. Farklı kurumsal yapıların ve araştırmacıların çalışmaları incelendiğinde genetiği değiştirilmiş organizmaların insan sağlığı ve çevre üzerine riskleri ile ilgili farklı sonuçların ortaya konulduğu görülmektedir. GD bitki ve ürün çeşitlerinin varlığının ve miktarının izlenmesi ve doğrulanması için düzenleme ihtiyacı GD bitki ve ürünlerin dünya çapında marketlerde görülmesi ile artmıştır. Bu nedenle, bitki ve bitki ürünlerinde GDO çeşitlerinin tespiti için güvenilir, hızlı ve düşük maliyetli methodların geliştirilmesine ihtiyaç vardır. GDO analizinde ilk adım genellikle GDO larda bulunan promotör veya terminatörler bölgelerinin taranmasıdır. GDO pozitif olarak tespit edilen örnekler üzerinde daha sonra kalitatif ve kantitatif olay spesifik ileri analizler pozitif tespitin kontaminasyondan kaynaklanmadığından emin olunması için gerçekleştirilmelidir. Bu durum GD ürünlerin etiketlenmesi için tanımlanmış eşik seviyelerinin olduğu ülkelerde de ciddi bir öneme sahiptir. Eş zamanlı PZR GDO tespiti ve kantifikasyonu için en yaygın kullanılan tekniktir. Bu teknik ile hedef genin çoğalması, floresan boyalar kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenebilir. En sık kullanılan floresan boyalar oligonükleotid problar, yüksek çözünürlükte erime boyaları ve DNA bağlama boyalarıdır. En spesifik tespit sadece hedef dizilerine bağlanan oligonükleotid problar kullanılarak yapılabilir. Bu nedenle yüksek maliyetli olmalarına rağmen oligonükleotit problar en çok tercih edilen floresan boyalardır. DNA bağlama boyaları ve yüksek çözünürlükte erime boyaları çift iplikli DNA molekülüne bağlanırlar. DNA bağlama boyaları belli bir konsantrasyonun üstünde kullanıldığında PZR ‘ı inhibe edebililir. Yüksek çözünürlükte erime boyalarının minimum PZR inhibisyon etkisi vardır. Ayrıca yüksek çözünürlükte erime boyaları DNA bağlama boyaları ile karşılaştırıldığında hidrojen bağlarına 4 kat daha fazla bağlanır ve üstün erime eğrisi çözünürlüğü elde edilir. Eş zamanlı PZR ile GDO tespitinde en çok hedeflenen diziler karnabahar mozaik virüse ait 35S promotörü (p35S); karnabahar mozaik virüse ait 35S terminatorü (t35S); figwort mozaik virüse ait 35S promotörü (FMV); Agrobacterium tumefacien’e ait nopalin sentaz geni terminatörü (tNOS), nopalin sentaz promotörü (pNOS) ve 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate sentaz (epsps) geni; Streptomyces hygroscopicus’a ait bar geni (BAR); Streptomyces viridochromogenes’a ait phosphinotricin-Nacetyltransferases (pat) genleridir. Bu çalışmada, GDO lu bitkilerin %99 undan fazlasının içerdiği karnabahar mozaik virüse ait 35S promotörü (p35S); figwort mozaik virüse ait 35S promotörü (pFMV); Agrobacterium tumefacien’e ait nopalin sentaz geni terminatörü (tNOS) dizilerinin aynı anda tespiti için tek bir yüksek çözünürlükte erime (HRM) boyası kullanılarak çoklu eş zamanlı PZR methodu geliştirildi. Farklı PZR ürünleri arasındaki ayrım hedef DNA ların erime sıcaklıkları farklılıklarına dayalı olarak yapılmıştır. Ayrıca, bu elementlerin taranması için gerekli olan toplam analiz süresini kısaltmak için enzim içermeyen DNA ekstraksiyon yöntemi geliştirildi. PZR tabanlı metodolojilerde hassas ve etkili sonuçlar elde etmek için yüksek kaliteli DNA gereklidir. Bu çalışmada, yüksek miktarda ve kalitede DNA elde etmek için soya ve mısır örnekleri üzerinde 5 farklı silika kolon tabanlı DNA ekstraksiyon protokolleri denenmiştir. Protokollerin üçü enzimatik adımlara dayanırken diğer 2 protokol ise tamamen kimyasal ve fiziksel hücre parçalama yöntemine dayanmaktaydı. Yöntemlerin hepsinde guanidin tiyosiyanat PZR inhibitörü inaktivasyonu ve DNA bağlanması için bir kaotropik ajan olarak kullanılmıştır. GDO tespiti için mevcut DNA ekstraksiyon metodolojileri en az 1,5 μg DNA ve 1.6 ve 2.0 arasında A260/280 oranı ile sonuçlanmalıdır. Tüm geliştirilmiş methodlardan elde edilen DNA ekstraktların A260/280 oranı istenilen aralıkta elde edildi. Tüm protokoller ile minimum limitden en azından 10 kat daha fazla olan 15 μg’ dan daha fazla DNA elde edildi. DNA konsantrasyonu açısından en iyi sonuçları boncukla homojenizasyon ve hekzasetiltrimetil amonyum bromür (STAB) muamelesi içeren protokollerden elde edilmiştir. Proteinler 280 nm’ de absorbladığı için A260/A280 oranı DNA ektraktlarındaki proteinlerin varlığının hesaplanmasında kullanılır. Diğer taraftan, karbonhidratlar, fenoller, aromatik bileşikler ve ağır metaller gibi diğer tip PZR inhibitörlerinin varlığı da PZR sonuçlarını etkileyebilir. Karşılaştırmalı olarak eş zamanlı PZR verimliliğine farklı protokoller ile elde edilen DNA kalitesinin etkisini değerlendirmek için her protokolden aynı miktarda DNA kullanılarak eş zamanlı PZR gerçekleştirildi. Eş zamanlı PZR çalışmalarında genel bitki kloroplast DNA sını hedefleyen PZR primerleri kullanıldı. DNA konsantrasyonu ve saflığı farklı protokollerden elde edilen tüm seyreltilmiş DNA lar için aynı olması nedeniyle elde edilen Ct değerleri PZR inhibitörlerinin varlığına işaret etmiştir. Tüm DNA örnekleri bitki kloroplast DNA sına spesifik erime sıcaklığında pik vermiştir. Boncuk ile homojenizasyon ve STAB muamelesini içeren protokoller ile elde edilen DNA lardan elde edilen eşik döngüsü değerleri diğer protokollere göre yaklaşık olarak 2 döngü daha düşük olarak bulunmuştur. Bu durum PZR inhibitörlerinin elimine edilmesinde bu iki protokolün daha başarılı olduğunu gösterdi. Bu iki protokol arasındaki fark proteinaz K muamelesi adımının dahil edilmesidir. DNA izolasyonu için gerekli olan maliyet ve toplam süreyi azal°ak amacıyla proteinaz K içermeyen protokol seçildi. FMV, NOS, 35S pozitif referans gıda örnekleri akredite gıda kontrol laboratuarları tarafından temin edilmiştir. FMV, NOS, 35S pozitif gıda örneklerinden çıkarılan DNA’ lar hedef spesifik primer çiftleri kullanılarak çoğaltıldı. Amplifikasyon döngülerinden sonra erime eğrisi analizi gerçekleştirildi ve hedeflenen PZR ürünlerinin Tm leri hesaplandı. Hedef spesifik erime pikleri NOS spesifik reaksiyon için 73 ± 0.38˚C de, FMV spesifik reaksiyon için 80˚C ± 0.28˚C de, 35S spesifik reaksiyon için 82.26 ± 0.29˚C de ve bitki kloroplast DNA sına specifik reaksiyon için 82 ± 0.33˚C de elde edildi. Genellikle aynı amplikon için Evagreen kullanılarak yapılan eş zamalı PZR ile elde edilen erime sıcaklıkları 0.5 ve 1 ˚C arasında değişebileceği kabul edilmektedir. Bu çalışmada elde edilen standart sapmalar 0.4˚ C ’den daha düşük bulunmuştur. Ayrıca, bütün Evagreen eş zamanlı PZR reaksiyonları önemli ek amplifikasyon ürünleri olmadan tek bir spesifik sinyal üretmiştir. Eş zamanlı PZR kantifikasyon standatları referans örneklerin purifiye edilmiş PZR ürünleri kullanılarak hazırlandı. Seri dilüsyonlar hedeflenen genin 100-1010 kopyasını içeren standart örnekler hazırlanması için yapıldı. Tespit limitini elde etmek için gr örnek başına 1-100 kopya 35S ve NOS içeren soya örnekleri ve gr örnek başına 1-100 kopya FMV içeren mısır örneği hazırlandı. 35S, FMV, NOS hedefli methodolojiler için tespit limiti 1 gen kopya/gr gıda örneği olarak bulunmuştur. Ancak bu çalışmada standart karışımlar referans gıda kontrol laboratuvarından elde edilmediği için methodların tespit limitleri geçek tespit limitlerinin sadece kaba tahminleridir. 35S, NOS ve FMV kalıplarının DNA karışımı primerlerin spesifikliğini test etmek için hazırlanmıştır. DNA karışımı her spesifik primer çifti ile eş zamanlı PZR ile çoğaltıldı. Eş zamanlı PZR reaksiyonlarının spesifikliği tüm amplifiye PZR ürünlerinin sekanslanması ile incelenmiştir. Sonuçlar çoğaltılmış dizilerin amaçlanan hedeflere en az %99 benzer olduğunu göstermiştir. İlk olarak dubleks eş zamanlı PZR denemeleri her farklı DNA kalıplarının aynı miktarda eklenmesi ile gerçekleştirildi. Dubleks reaksiyonlarda daha fazla PZR ürünleri ile sonuçlanan daha fazla tercih edilen DNA kalıpları erime eğrisi analizi ile tespit edildi. FMV kalıplarından reaksiyonlarda daha fazla PZR ürünü elde edildi. 35S kalıpları ise 35S ve NOS kalıpları içeren PZR larda daha fazla tercih edildi. Dubleks PZR larda farklı ilk örnek miktarının etkisini belirlemek için sadece tek bir tip Tm piki elde edene kadar çalışmalara devam edildi. Genel sonuçlar iki farklı Tm piki 1/100 rölatif kalıp konsantrasyonları altında elde edilemezken iki farklı Tm piki 1/100 rölatif kalıp konsantrasyonları üzerindeki her hedef için elde edilebildiği gösterildi. Başarılı ikili karışım denemelerinden sonra her bir referans örnekten 1000 kopya kullanılarak üçlü karışım hazırlandı. Üç primer çiftinin çoklu eşmanalı PZR da beraber çalışabildiğini göstermek ve spesifik olmayan PZR ürünü veya primer dimeri oluşturmadığını göstermek için üçlü eş zamanlı PZR çalışmaları gerçekleştirildi. Üçlü kombinasyonlar referans örneklerin 1/1/1 röfatif kopya sayısı oranına uygulanmıştır. NOS, FMV ve 35S spesifik çoklu eş zamanlı PZR 3 farklı erime piki elde edilmesi ile sonuçlandı. NOS, FMV ve 35S hedeflerine karşılık gelen erime pikleri sırasıyla 73.04±0.13˚C, 80.21±0.10˚C ve 82.15±0.08˚C de gözlenmiştir. Çoklu reaksiyonlarda ek amplifikasyon gözlenmemiştir. Bitki DNA ları her zaman GDO tarama reaksiyonlarda baskın hedef olacağından, bitki DNA ları FMV, 35S ve NOS hedeflerinin tespit hassasiyetini artırmak için ikili ve üçlü DNA karışımlarına dahil edilmemiştir. Bitki spesifik eş zamanlı PZR lar GDO taraması reaksiyonlarında pozitif PZR amplifikasyon kontrolü olarak kullanılmıştır. Daha önce akredite gıda kontrol laboratuvarları tarafından analiz edilen ham ve işlenmiş gıda örnekleri geliştirilen metodoloji kullanılarak tekrar analiz edildi. Köfte, soya yağı, soya unu, mısır, mısır yağı, don yağı, kedi ve köpek mamaları, çikolata, baklava ve ekmek çeşitlerini içeren toplam 96 örnek analiz edildi. Sonuçlarımız akredite gıda kontrol laboratuvarlarında elde edilen sonuçlar ile %100 uygumludur. Bu çalışma tek bir yüksek çözünürlükte erime boyası kullanılarak 35S, NOS ve FMV bölgelerinin eş zamanlı çoklu tespitinin mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca enzimatik olmayan hücre parçalama yöntemlerini kullanarak yüksek kalitede DNA elde edilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir.