FBE- Nano Bilim ve Nano Mühendislik - Doktora

Bu koleksiyon için kalıcı URI

http://hdl.handle.net/11527/185

Gözat

Yazar "Saraç, Abdülkadir Sezai" ile FBE- Nano Bilim ve Nano Mühendislik - Doktora'a göz atma
  • Öge
    Kemik Doku Rejenerasyonu İçin Elektroaktif-biyoaktif Biyomalzeme Olarak P3ana/pcl Nanofiberleri: Sentez, Karakterizasyon Ve Hücre Çalışmaları
    (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016-06-20) Güler, Zeliha ; Saraç, Abdülkadir Sezai ; 10110721 ; Nano Bilim ve Nano Mühendislik ; Nanoscience and Nanoengineering
    Doku mühendisliği, organa özgün hücrelerin bir iskelet yapı üzerinde çoğaltılması ile yapay doku ve organların üretilmesini sağlamaktadır. Doku mühendisliğinde kullanılan iskelet, doğal hücredışı matrisi taklit ederek,  hücrelere geçici olarak destek sağlayan üç boyutlu bir taslak olarak görev almaktadır. Hücreler, iskelet üzerinde çoğalır, göç eder ve özgün hücrelere farklılaşırlar. Kullanılan iskelet, hücrelere gerekli olan kimyasal, morfolojik ve yapısal sinyaller iletmektedir. Bu nedenle, istenilen şekil, boyut ve işleve sahip dokunun oluşturulması amacıyla iskelet seçimi oldukça önemlidir. İskelet tasarımında biyouyumluluk ve porozite gibi çeşitli özelliklerin gözönünde bulundurulması gereklidir. Porlu yapıları ve geniş yüzey alanına sahip olmalarından dolayı nanofiberler doku mühendisliği iskeleti olarak ideal yapılardır. Nanofiber, boyutları ve fibrilli yapıları dolayısıyla doğal hücredışı matrise benzerlik göstermektedir. Elektrospin yöntemi ile sentetik veya doğal polimerler kullanılarak, doku mühendisliği iskeleti olarak kullanılmak üzere nanofiberler üretilmektedir. Polimerik malzemeler arasında, poli(ε- kaprolakton) (PCL) ve PCL içeren kopilimer veya karışımlar doku mühendislik çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır. PCL nanofiberleri biyobozunur, biyouyumludur ve özellikler kemik doku mühendisliği çalışmalarına uygun mekanik özelliklere sahiptir. Nanofiberlerin morfolojik özelliklerine rağmen, hücre ve nanofiber arasındaki etkileşimin arttırılması ve doku yenilenmesinin uyarılması amacıyla, hücrelerin fiziksel veya kimyasal faktörlerle uyarılması gerekmektedir. Nanofiberler, büyüme faktörlerinin nanofiber yüzeyinde bulunan fonksiyonel gruplara kovalent olarak immobilizasyonu ile kimyasal olarak modifiye edilebilirler. Fiziksel uyaran olarak ise, özellikle kemik dokusunu uyarmak üzere elektriksel uyarı kullanılabilir. Hem fiziksel hem de kimyasal uyarıların doku mühendisliğinde kullanılabilmesi için uygun bir iskelet malzemenin seçilmesi gerekmektedir. Bu doğrultuda iletken polimerin kullanımı uygun bir alternatif sağlamaktadır. Son yıllarda iletken polimerlerin doku mühendislik uygulamalarında kullanımı ilgi çekmektedir. Polianilin ve türevleri, biyouyumlu ve elektrokimyasal özellikleri tanımlanmış iletken polimerlerdir. Ancak, polianilin ve türevleri çeşitli çözücüler içerisindeki çözünürlüğünün sınırlı olması nedeniyle sınırlı işlenebilirliğe sahiptirler. Bu sorunun aşılması amacıyla anilin monomeri çeşitli fonksiyonel grupların monomere eklenmesi ile modifiye edilmektedir. Poli(m-antranilik asid) (P3ANA), anilin monomerine karboksil (-COOH) grubu eklemesi ile elde edilmiş bir polianilin türevidir. P3ANA yapısına eklenen karboksil grubu, polimerin sulu ve sulu olmayan çözücüler içerisinde çözünmesi sağlamaktadır. P3ANA, iyi tanımlanmış elektrokimyasal özellikleri, yapısında bulunan fonksiyonel grupların varlığı bakımından hem elektriksel uyarıların hücrelere iletilmesi hem de nanofiberlerin biyomoleküller ile kovalent olarak modifiye edilemesi için uygun bir iletken polimerdir.  Hücrelere kimyasal ve fiziksel biyoaktif sinyaller ileten bir elektoaktif ve biyoaktif nanofiber hücre iskeleti üretilmiştir. Poli(ε-kaprolakton)/poli(m-antranilik asit) (PCL/P3ANA) nanofiberleri, PCL çözeltisine artan miktarda P3ANA ilave edilmesinin ardından elektrospin yöntemi ile elde edilmiştir. Fiber yapısına artan miktarda P3ANA eklenmesi, daha küçük fiber çapına, daha fazla yüzey pürüzlülüğüne ve yüzey alanına sahip nanofiberlerin üretilmesini sağlamıştır. PCL/P3ANA nanofiberlerinin geniş yüzey alanına sahip olması, nanofiberlerin büyüme faktörleri ile biyoişlevsel hale getirilmesi için daha fazla uygun bölge ve karboksil grubu sağlamaktadır. Nanofiber yapısına artan miktarda P3ANA ilave edilmesi, nanofiberlerin yapısal özelliklerinin değişmesine neden olarak nanofiberlerin mekanik özelliklerini iyileşmesine neden olmuştur. Elektrokimyasal empedans spektroskopik (EIS) ölçümler, PCL/P3ANA nanofiberlerinde bulunan P3ANA miktarının artmasıyla birlikte, oluşan nanofiberlerin yük transfer direncinin düştüğünü ve daha yüksek iletkenliğe sahip nanofiberlerin elde edildiğini göstermiştir. Bu yüksek elektroaktivite hücrelere elektriksel sinyallerin iletilmesi bakımından avantaj sağlamaktadır. Bu sepeble, yapısında en fazla miktarda P3ANA içeren PCL/P3ANA nanofiberlerinin en fazla yüzey alanına, en iyi mekanik ve elektokimyasal özelliğe sahip olmasından dolayı, bu nanofiberler büyüme faktörleri ile işlevsel hale getirilmiş ve hücrelerin elektriksel olarak uyarılması çalışmalarında kullanılmıştır.  Proteinlerin, PCL/P3ANA nanofiber hücre iskeletine kovalent olarak bağlanması sonucu biyoişlevsel hale getirilmesi 1-etil-3-(dimetil-aminopropil) karbodiimid hidroklorid (EDC) and N-hidroksisuksinimid (NHS) aktivayonu işlemi ile gerçekleştirilmiştir. Nanofiber yapısında bulunan karboksil gruplarının aktivasyon verimi, değişen EDC/NHS konsatrasyonuna bağlı olarak spektroskopik ve morfolojik olarak incelenmiştir. Elektrokimyasal empedans spektroskopik ölçümler, karboksil gruplarının aktivasyon derecesine bağlı olarak nanofiberlere kovalent bağlanan protein miktarının değiştiğini göstermiştir. Aktivasyon süreci detaylı olarak incelenmiş ve 50/50 mM EDC/NHS konsantrasyonunun nanofiberleri en etkili şekilde aktive eden konsatrasyon olduğu bulunmuştur. Elde edilen nanofiberler arasından hücre kültür çalışmalarında kullanılmak üzere uygun nanofiberlerin seçilmesinden ve kovalent protein immobilizasyonu için en etkili EDC/NHS konsatrasyonun belirlenmesinin ardından, PCL/P3ANA nanofiber hücre iskeleti, in vitro hücre kültür çalışmalarında kullanılmak üzere kemik morfogenetik protein-2 (BMP-2) ve RGD peptid büyüme faktörleri ile biyoişlevsel hale getilmiştir. BMP, kemik oluşumunu destekleyen güçlü bir osteoindüktif faktördür. BMP varlığı, mezenkimal kök hücrelerin alkalin fosfataz aktivitesinin artışına neden olarak osteoblastik fenotipe yönelimini uyarmaktadır. RGD peptid ise birincil kemik hücre cevabını arttırmak üzere bir adezyon peptidi olarak nanofiber yapısına dahil edilmiştir. RGD peptid, mezenkimal kök hücrelerin osteoblastik farklılaşmasını sağlar ve hücre çoğalmasını arttırır. Hücre ve nanofiber iskelet arasındaki etkileşimini arttırarak, hücrelerin nanofiber üzerinde yayılmasını sağlamaktadır. Nanofiberlere bağlanan BMP-2 ve RGD peptid miktarı bikinkoninik acit (BCA) protein deneyi ve Enerji-Dağılımlı X-ray Spektroskopisi (EDX) ile N atomlarının elemental analizleri sonucu belirlenmiştir. Temas açısı deneyleri sonucunda, yüzeye protein bağlanmasının ardından hidrofobik özellik gösteren nanofiber yüzeyinin hidrofilik özellik kazandığı görülmüştür. EIS ölçümleri, nanofiberlere bağlanan proteinlerin nanofiber çift tabaka kapasitansı ve yük transfer direncinin artmasına neden olduğunu göstermiştir. Nanofiberler, Saos-2 hücreleri üzerinde toksik etki göstermemiş ve hücrelerinin tutunma ve büyüme özelliklerini desteklemiştir. En fazla hücre çoğalması RGD peptid immobilize edilen nanofiberler üzerinde gözlenmiştir. Hücre canlılığının, hücrelerin adhezyonu ve nanofiberin yapısal özellikleri ile ilişkili olduğu görülmüştür. PCL, PCL/P3ANA ve PCL/P3ANA-RGD nanofiberleri üzerinde büyütülen hücrelerin morfolojileri birbirine benzerlik göstermiş ve poligonal şekil sergilemiştir. BMP-2 ile işlevsel hale getirilen nanofiber üzerinde büyütülen hücreler osteosit benzeri morfoloji göstermiştir. Cam lamel, PCL, PCL/P3ANA, BMP-2/PCL/P3ANA ve PCL/P3ANA-RGD nanofiberleri üzerinde büyütülen Saos-2 hücrelerinin alkalin fosfataz (ALP) aktivetisi ve kalsiyum birikimi incelenmiştir. BMP-2 immobilize edilmiş nanofiberler üzerinde büyütülen hücreler, diğer nanofiber ve cam lamel üzerinde büyütülen hücrelere kıyasla en fazla ALP aktivitesi ve kalsiyum birikimine sahip olarak, en yüksek osteogenez derecesine sahip olmuştur. Elektriksel uyarının kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin kemik hücresine farklılaşmasına etkisi ve PCL/P3ANA nanofiberlerinin elektriksel sinyalleri hücrelere iletimi incelenmiştir. Hücrelerin elektriksel olarak uyarılması amacıyla, 0.5 kHz, 1 kHz, 5 kHz ve 10 kHz frekansta; 200 mV/mm, 400 mV/mm and 800 mV/mm elektrik alan (birim mesafede uygulanan voltaj) uygulanmıştır. En yüksek hücre canlılığı 1 kHz frekans uygulanması ile elde edilmiştir. 0.5 kHz ve 1 kHz frekansta en yüksek hücre canlılığı ise hücrelere 400 mV/mm elektrik alan uygulandığında gözlenmiştir. 800 mV/mm elektrik alan uygulandığında ise uygulanan frekanstan bağımsız olarak hücre canlılığı % 50 oranında düşmüştür. Yüksek frekans (5 kHz ve 10 kHz) hücre canlılık değerlerinin belirgin bir şekilde düşmesine neden olmuştur. Elektriksel uyarı varlığında PCL/P3ANA nanofiberleri üzerinde büyütülen hücreler, nanofiberler üzerine yayılarak çoğalmışlardır. 200 mV/mm ve 400 mV/mm voltaj uygulandığında kök hücreler, adherent hücrelerin sahip olduğu aktin uzantılarıyla birlikte osteosit benzeri morfoloji göstermişlerdir. Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin osteojenik farklılaşmasını incelemek adına, hücreler ALP aktivetesi ve kalsiyum birikiminin gösterilmesi için boyanmıştır. Hücreler, çoğalma testinde görülen eğilime uygun olarak ALP aktivitesi ve kalsiyum birikimine sahip olmuştur. 800 mV/mm voltaj uygulanan hücreler ALP aktivitesi ve mineralizasyon göstermemiştir. Hücrelerin düşük osteogenez derecesinin, yüksek voltaj uygulanması ile hücre canlılığının azalması ile ilişkili olduğu görülmüştür. En fazla kalsiyum birikimi ve ALP aktivitesi hücreler 1 kHz frekansta 400 mV/mm voltaj ile uyarıldıklarında görülmüştür. Hücrelerin elektriksel uyarıya verdikleri cevabın incelenmesi ile, nanofiber yapısında bulunan P3ANA polimerinin, nanofiberler üzerindeki kemik iliği mezenkimal kök hücrelerine elektriksel sinyalleri iletebildiği gösterilmiştir.