Lakkaz Enziminin Ptfe Membranlara Çeşitli Yöntemlerle Tutuklanması

Abstract

Fenolik bileşikler çeşitli sanayilerin yan ürünüdürler ve atıksularla birlikte atılırlar. Bu nedenle bu bileşiklerin tespit edilebilmesi çevrekoruma ve kontrolü için büyük önem taşır. Bu bileşikleri için kullanılan geleneleneksel tayin teknikleri genellikle çok zaman alır, pahalıdır ve yerinde tespite olanak tanımaz. Bu nedenle alternatif olarak biyosensörler dizayn edilebilir. Bu çalışmanın amacı Trametes versicolor’dan izole edilmiş lakkaz enzimini kullanarak HPLC gibi analiz metodlarına alternatif, taşınabilir ve kullanımı kolay bir biyosensör inşa etmektir. Bu amaç için lakkaz enzimi üç farklı yötem kullanılarak PTFE membranlara tutuklanmıştır ve hassasiyet, raf ömrü, tekrar kullanılabilirlik vs, gibi kriterler karşılaştırılarak en uygun teknik belirlenmeye çalışılmıştır. Enzim aktivitesi ölçümleri için oksijen elektrodu kullanılmıştır. Kullanılan metodlardan biri olan jelatin içine hapsetme tekniği çok kullanılan ve kolay hazırlanan bir metoddur. Bu nedenle çalışmamızda kullandığımız yeni metodların performansını değerlendirebilmek için kullanılmıştır. Diğer iki tutuklama metodu için PTFE membranlar plazma uygulamaları ile poliakrilamid ve poliakrilik asit ile aşılanmıştır. Poliakrilamidin PTFE membranlara aşılanması için iki basamaklı bir polimerizasyon işlemi uygulanmıştır. Membranlar yüzey ıslanırlığını artırabilmek için once hidrojen plazması (125 W, 13 Pa, 2 dk) ile muamele edilmiştir. Böylece akrilamid monomer çözeltisinin (etanol/aseton %50 h/h içerisinde %50 ağırlık/hacim) yüzeye yayılabilmesi sağlanmıştır. Yüzeyine monomer yayılmış PTFE polimerizasyonu başlatmak için argon plazması (50 W, 13 Pa, 1 dk) ile muamele edilmiştir. Akrilamid aşılanması (pAAm-g-PTFE) ile yeni oluşan amin grupları ATR-FTIR kullanılarak tespit edilmiştir. Üçüncü metodda ise PTFE membranlar argon plazması (50 W, 13 Pa, 1 min) ile muamele edilerek yüzeylerinde polimerizasyon için gereken peroksit grupları oluşumu sağlanmıştır. Sonrasında ısı uygulaması ile (70 o C, 6 saat). akrilik asidin yüzeye aşılanması sağlanmıştır. Poliakrilik asit aşılanması ile oluşan karboksil grupları ATR-FTIR kullanılarak tespit edilmiştir. Bu iki metod içinde optimize edilmiş karbodiimid bağlama reaksiyonu kullanılarak enzimleri tutuklanmıştır. Yapılan üç biyosensör optmimum çalışma koşulları, Raf ömrü ve tekrar kullanılabilirlik bakımından karşılaştırılmıştır. Yapılan deneyler sonucunda jelatin içerisine tutuklanmış lakkazın aktivitesinin yüksek olmasına rağmen, mekanik dayanıksızlığı ve jelatin tabakasının saklanmasındaki problemler nedeniyle çoklu kullanım ve saha ölçümleri için çok uygun olmadığı görülmüştür. Yaptığımız araştırmalara göre pAAc-g-PTFE biyosensörü diğer iki biyosensöre göre daha kararlı ve tekrar kullanılabilirliğinin daha yüksek olduğu ve saha kullanımı için yeterli aktiviteye sahip olduğu görülmüştür. Bu nedenle fenolik asitlerin tayin yöntemlerine bir alternatif olarak pAAc-g-PTFE biyosensörünü teklif ediyoruz.

Phenolic compounds are byproducts of a number of industrial applications and discharged by wastewaters. Therefore detection of these compounds is very important for environmental protection and control. Conventional techniques for their detection are generally time consuming, expensive and do not allow to make measurements in the field. Biosensors are therefore could be designed as alternative tools for this purpose. The aim of the study is to construct a biosensor from laccase enzyme isolated from Trametes versicolor as a portable, easy-to-use alternative to known analytical methods like HPLC. To do this, laccase was immobilized on PTFE using three different techniques and the most suitable technique was determined in terms of sensitivity, storage stability, reusability, etc. Enzyme activity was measured by using an oxygen electrode for each case. One of the immobilization methods, entrapment to gelatin, is a well-known and easy-to-prepare method so it was chosen to compare its performance with that of the new method that we proposed. For the other two immobilization methods, PTFE membranes were grafted with polyacrylamide and polyacrylic acid respectively using plasma discharge treatment. For polyacrylamide grafted PTFE, a two step polymerization process was used. The membranes were treated with hydrogen plasma (125 W, 13 Pa, 2 min) to increase surface wettability, thus allowing the acrylamide monomers (50% w/v in ethanol/acetone 50% v/v) to spread on the surface. Then argon plasma (50 W, 13 Pa, 1 min) was applied to initiate polymerization. Newly formed amide groups in polyacrylamide grafted PTFE (pAAm-g-PTFE) were detected by ATR-FTIR. For the third method, PTFE was treated with argon plasma (50 W, 13 Pa, 1 min) to generate peroxide groups required for polymerization. Acrylic acid was then grafted to the surface by heat treatment (70 o C, 6 h). The carboxyl groups in (pAAc-g-PTFE) were confirmed by ATR-FTIR. For both case, an optimized carbodiimide coupling reaction was used for enzyme immobilization. Then all three biosensor were characterized and compared in terms of optimum working conditions, storage stability and reusability. Our study concluded that although the activity of the gelatin entrapped laccase is better, the mechanical instability and poor storage life of gelatin layer makes the gelatin biosensor unattractive for multiple usage and for field measurements compared to the other two biosensors. Our investigation suggests that the pAAc-g-PTFE biosensor is more stable and highly reusable than the other two biosensors and its sensitivity is suitable for field applications. Therefore, the pAAc-g-PTFE biosensor could be proposed as an alternative on-site detection tool for phenolic compound monitoring.