Bsldh Enziminde Q102r Ve Q203l Çift Mutantının Substrat Özgüllüğü Ve Aktivatör Gereksinimine Etkileri

Abstract

Enzimler, organizmada meydana gelen pek çok reaksiyonun katalizini gerçekleştiren biyolojik aktivatörlerdir. Enzimler, girdikleri reaksiyonun yönünü değiştirmezler; ancak tepkimenin aktivasyon enerjisini düşürerek kimyasal dengeye gelme sürecini hızlandırırlar. Bu olgu, enzimlerin “aktif bölge” olarak adlandırılan kısımlarında substratlarıyla kompleks oluşturma özelliklerinden kaynaklanır. Enzimler biyomedikal araştırmalar, ilaç sanayi ve pek çok ticari ürün eldesinde yaygın olara kullanılmaktadır. Günümüzde, deterjanlardan fermente içecek yapımına kadar pek çok uygulamada mikroorganizmalar tarafından büyük ölçekli olarak üretilen enzimler rol alır. 2000 yılı verilerine göre tahmini endüstriyel enzim pazarı değeri yaklaşık 1.5 milyar dolardır. Kimyasal katalizörlerle karşılaştırıldığında yenilenebilir kaynaklardan elde edilmeleri, biyolojik olarak çözünebilmeleri, daha elverişli pH ve sıcaklık koşullarında çalışabilmeleri enzimleri çok daha tercih edilir duruma getirmiştir. Öte yandan artan nüfus ve azalan doğal kaynak baskısı, daha az kirlilik meydana getiren üretim yöntemlerini tercih etme gerekliliğini ortaya koymuştur. Klasik kimyasal katalizörlere karşı üstünlükleri, enzimleri giderek daha önemli endüstriyel ürünler haline getirse de, çoğu enzim ticari uygulamalar açısından gerekli özellikleri barındırmaz. İstenen koşullarda, daha yüksek verimle, daha fazla substrat kullanarak çalışabilen enzimler üretmek protein mühendisliği uygulamalarıyla mümkün hale gelmiştir. Bu uygulamalarda rasyonel dizayn ve yönlendirilmiş evrim olmak üzere iki ana yöntem ile bu ikisinin olumlu özellikleri alınarak elde edilmiş yarı-rasyonel dizayn sistemi kullanılmaktadır. Rasyonel dizayn, bilgisayar programlı modelleme ve biyoinformatik bilgisi ışığında proteinin yapısal ve işlevsel özelliklerini ortaya koyma ve buradan hareketle hedeflenen bölgelerde mutasyon yapma esasına dayanır. Yönlendirilmiş evrim ise doğal bir süreç olan evrim mekanizmasını laboratuvar ortamında ve moleküler seviyede taklit eder. Bu yöntemde, ilgili protein dizisi üzerinde rastgele mutasyonlar oluşturulur, daha sonra mutant bireyler, proteinin değiştirilmek istenen karakterini taşıyıp taşımamalarına göre ayırt edilir. Yarı-rasyonel dizayn ise bir yandan rasyonel dizayndaki yapı ve fonksiyon bilgisi gerekliliğini, diğer yandan yönlendirilmiş evrimdeki çok sayıda birey tarama zorluğunu ortadan kaldırır. Laktat dehidrogenaz (LDH) enzimi, glikolizin son adımında piruvatı laktata dönüştüren enzimdir. NAD-bağımlı 2-hidroksikarboksilat dehidrogenazlar ailesinin üyesidir. Piruvatın laktata çevrilmesi reaksiyonunu terisinir olarak katalizlerken kofaktörü olan NADH’yi de NAD+’a yükseltger. Hemen her organizmadan izole edilen LDH, oksijenli ve oksijensiz solunum yolaklarında kullanılabilen bir ara ürün olan piruvatı üretimi/tüketimi bakımından önemlidir. Prokaryotik ve ökaryotik olmak üzere, bilinen iki tip LDH vardır. Bacillus stearothermophillus bakterisinden elde edilen L-laktat dehidrogenaz enzimi (bsLDH), eczacılık ve zirai kimyasallarda kullanılmak üzere kiral yapıtaşları elde etme işleminde ticari yönden oldukça önemlidir. Her ne kadar yüksek stereo uygunluk seviyesiyle kiral hidroksiasitlerin sentezine olanak sağlasa da, bsLDH dar substrat özgüllüğüyle endüstriyel üretim açısından dezavantaj oluşturmaktadır. Termofil bir bakteriden elde edilen ve bu yüzden ısıya karşı oldukça stabil olan bu enzim substrat kullanımını artırmak için oldukça uygun bir hedeftir. Öte yandan, bsLDH enzimi fruktoz 1,6 bisfosfat (FBP) tarafından aktive edilmektedir. Aktivasyon, dimerik formda düşük substrat afinitesi gösteren enzimin, FBP bağlanmasıyla çok daha aktif olan tetramerik forma geçmesiyle gerçekleşir. Bu aktivatör pahalı olmakla beraber, endüstriyel süreçte istenmeyen ko-faktör problemlerine yol açar. Protein mühendisliği yöntemleriyle, enzimin aktivatör kullanımını azaltmak hedeflenmektedir. Günümüze kadar yapılan çalışmalar, rasyonel ve randomize mutajenik metotlar kullanarak, enzimin substratlarının artırılmasında ve özgüllüğünün değiştirilmesinde önemli yol kat etmeyi sağlamıştır. Örneğin, Wilks ve arkadaşları, bsLDH dizisinde Q102R mutasyonuyla, substrat kullanımını laktat-piruvat çiftinden oksaloasetat-malat çiftine dönüştürmeyi, yani LDH gen dizisinde değişiklik yaparak malat dehidrogenaz işlevi gören bir enzim tasarlamayı başarmıştır. Başka bir çalışmada Allen ve arkadaşları, üç dizi randomize mutagenez ve tarama yöntemiyle FBP yokluğunda da aktif, üç amino asit mutasyonu taşıyan (R118C, Q203L, N307S) 6A mutantı üretmiştir. Mutantın sözü edilen aktivasyon özelliğini göstermesinde etkili bölge olarak dimer-dimer arayüzünde bulunan Q203L mutasyonu gösterilmektedir. Yabanıl tip bsLDH için FBP varlığında KMpyr 5mM iken, FBP ile aktive edildiğinde KMpyr 0.05 mM’a düşer. 6A mutantında ise FBP yokluğunda KMpyr 0.07 dir. Bu da FBP’li yabanıl tip değerine oldukça yakındır. Bu çalışmada amaçlanan, bsLDH enziminin, sözü edilen Q102R ve Q203L mutantlarını aynı dizide oluşturarak çift mutant elde etmek ve bunun FBP gereksiniminin yanı sıra substrat özgünlüğünü araştırmaktır. Bunu gerçekleştirmek için, pQE-2 klonlama vektörü içinde bulunan bsLDH gen dizisinde, bölgeye özel mutagenez sistemi kullanılarak Q102R ve Q203L mutasyonları oluşturulmuştur. Öncelikle Polimeraz Zincir Reaksiyonunda (PZR) kullanılmak üzere uygun oligonükleotitler tasarlanmıştır. PZR’yi takiben, mutant çift sarmal DNA’ların seçimi Dpn I yıkımıyla gerçekleştirilmiştir. Sonrasında BL21 kompetent E. coli genotip fhuA2 [lon] ompT gal [dcm] ΔhsdS hücrelerinde transformasyon yapılmış ve plazmit DNA’sı saflaştırılmıştır. Örnekler dizilemeye tabi tutulmuş ve doğru mutantların elde edildiği, yabanıl tip dizi ile mutant dizi karşılaştırılarak teyit edilmiştir. Elde edilen veriye göre bsLDH dizisinde Q102R ve Q203L mutasyonları gerçekleşmiştir. Mutant diziye sahip DNA, E. coli hücrelerinde çoğaltılmış, besi yerleri çöktürülerek protein izolasyonu için hücre eldesi sağlanmıştır. 6-His-tag’le işaretlenen LDH proteini, bu diziyi seçici olarak tanıyan ve ortamdan izole edilmesini sağlayan Ni-NTA agaroz ile ayrıştırılmıştır. Sodyum dodesil sülfat – poliakrilamid jel elektroforeziyle (SDS-PAGE) kendi moleküler ağırlığına karşılık gelen bölgede görüntülenerek proteinin elde edildiği doğrulanmıştır. Ardından, ultrafiltrasyon yöntemiyle LDH dışındaki tüm proteinler ortamdan uzaklaştırılmış, daha saf bir enzim eldesi sağlanmıştır. Yabanıl tip ve mutant enzimlerin kinetik ölçümleri FBP varlığında ve yokluğunda substrat olarak değişen konsantrasyonlarda piruvat kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bunun sonucunda yabanıl tip LDH kinetik ölçümleri FBP varlığında, literatürdekine çok yakın değerler vermiştir. Öte yandan, mutant enzimin piruvat ile kinetik ölçümlerinden saptanabilir bir veri elde edilememiştir. Bu durum, Q102R mutasyonu ile malat dehidrogenaz işlevi gösteren enzim oluşturulması durumuyla örtüşmekte ve yapılan mutasyonun doğru çalıştığına işaret etmektedir. Benzer kinetik deneyler, malat ve oksaloasetat substratları ile tekrar edilecek, çift mutant etkisi daha kesin şekilde aydınlatılacaktır.

Enzymes are biological catalysts that play role in chemical transformations, thus they are important for several branches of industries. The L-lactate dehydrogenase (LDH) from Bacillus stearothermophillus(bs) is substantial for the synthesis of pharmaceuticals and agrochemicals as it provides the production of chiral building blocks. It enables the reaction that generates hydroxy acids from their corresponding oxoacids. Moreover, because Bacillus stearothermophillus is a thermophilic bacterium, the enzyme is highly stable to heat. However, the enzyme has a limited substrate specificity. On the other hand, the enzyme is activated by an expensive activator, fructose 1,6 bisphosphate (FBP). FBP also shows undesirable co-factor complications for industrial processes. Besides, bsLDH activity is inhibited by excess substrate (pyruvate), which is once more a deleterious feature owing to its industrial use. All these characteristics make bsLDH an applicable target for protein engineering. Previous studies have provided significant developments over these unwanted properties by using rational and randomized mutagenic methods. For instance, by Wilks et al., a Q102R substitution (found in the naturally occurring malate dehydrogenases) on the bsLDH sequence has been shown to convert the substrate specificity from lactate to malate by 3 orders of magnitude. In another research, Allen and Holbrook succeeded in producing a mutant (6A) which is almost fully activated in the absence of FBP. This 6A mutant had three amino acid replacements: R118C, Q203L and N307S, resulting in a 70-fold activation. Normally FBP activates the enzyme by enabling structural rearrangements which turns the protein into tetrameric form from dimeric form. Because the Q203L is located at the dimer-dimer interface, this substitution is thought to have realized the substrate switch by altering the dimer-tetramer equilibrium. By our laboratory, similar protein engineering applications have yielded significant effects on bsLDH as well. For example, by D38R replacement, using PCR based overlap extension mutagenesis, the substrate inhibition was decreased threefold by Binay and Karaguler. In another study, recombinant colonies, formed by random mutagenesis were screened and a more efficient malate dehydrogenase, compared to Q102R variant, was produced. Our aim in this study is forming a double mutant form of bsLDH enzyme and investigate its effect both on the activator need and on substrate specificity. In order to achieve this, Q102R and Q203L mutants were constituted by site-directed mutagenesis in bsLDH sequence which was found in pQE2 vector. To be used in the PCR reaction, appropriate oligonucleotides were designed to generate Q102R and Q203L mutations. Following the PCR with these oligos, mutant dsDNAs were selected by Dpn I digestion. After that, mutated DNA was transformed into E.coli strain BL21 E. coli genotype fhuA2 [lon] ompT gal [dcm] ΔhsdS competent cells. Plasmid DNA was purified following the transformation and samples were sequenced to ensure to have achieved the correct mutations. According to the data obtained, Q102R and Q203L mutations are formed in bsLDH sequence. Mutated DNA was amplified in large-scale E.coli culture and the culture was precipitated in order to obtain protein from cells. Desired protein with 6xHis-tag was sorted from the protein pool by Ni-NTA resin system which selectively binds His-tagged proteins. Thereafter, by Sodium Dodecyl Sulphate Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), the protein was visualized at the region of its molecular mass (35kDa) and have ensured to obtain the enzyme. By ultrafiltration, smaller proteins and other contaminants were removed and a purer enzyme was attained. With different concentrations of pyruvate as substrate, wild type and mutant enzyme kinetic measurements were realized in the absence and presence of FBP. Wild type data were found quite consistant with the previous studies. But we could not get detectable results in mutants with pyruvate. Actually, this phenomenon agrees with the Q102R mutant feature, which gives rise to a malate dehydrogenase upon mutation. Further experiments will be made with malate and oxaloacetate substrates to more precisely elucidate the double mutant effect.