Lipozom Fosfolipid İçeriğinin Yüzeye Bağlı Yapay Lipit Membran Modelinin Oluşumu Üzerindeki Etkisi - Türken, Başak (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013)
Biyolojik membranlar, oldukça karmaşık ve dinamik yapısıyla, hücre canlılığının çok önemli bir bileşenidir. Hücre canlılığının ve özgün hücre işlevlerinin sürekliliğini mümkün kılan çok önemli bazı fonksiyonları yerine getirir. Karmaşık yapılarından dolayı, farklı membran bileşiklerinin çalışılabilmesi için yeni yapay lipit membran modellerinin geliştirilmesi çok önemlidir. Katı bir yüzeye bağlı lipit membran modeli (tBLMs), çift katmanlı lipit membranların taklit edilmesi için uygun bir ortam sağlar. Bu yapay lipit membran modelinde, çift katmanlı lipit membran yüzeyden hidrofilik bir ara tutucu molekülle ayrılır. Böylece lipit membranın katı yüzeyden etkilenmesi ve stabilitesinin artması amaçlanır. tBLMs, biyosensör uygulamaları veya biyomembranların ve membran proteinlerinin yapı ve fonksiyonlarının araştırılmasında kullanılan bir yapay lipit membran modelidir. Memeli hücre membranları 1000 değişik fosfolipid çeşidi içerir. Bu kadar çeşitli fosfolipid miktarı, membranın akışkanlığını ve membrana gömülü olan proteinlerin işlevlerini belirler. Bir çok memeli hücresinin plazma membranında, fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE) ve fosfatidilserin (PS) en çok bulunan fosfolipitlerdir. Bunlardan sadece PS negatif yük taşır, diğer ikisi fizyolojik pH’ta elektriksel olarak nötr haldedir: bir negatif bir de pozitif yük taşırlar (zwitteriyonik). Fosfatidilkolin (PC), en çok bulunan fosfolipid çeşididir ve memeli hücre membranlarının %40-50’sini oluşturur. PC, primer hücre membran bileşiklerinin üretilmesinde rol oynar, aynı zamanda asetilkolin sentezindeki başlıca bileşendir. Fosfatidiletanolamin (PE), ikinci en sık bulunan fosfolipid çeşididir ve memeli hücre membranlarının %20-50’sini oluşturur. PE, membranlarda çok sayıda yapısal rol oynar. Fosfatidilserin (PS), nicel olarak az sayıda bulunur ve memeli hücre membranlarının %2-10’unu oluşturur. PS, sinir sistemi ve görme duyusunun oluşumunda çok önemli rol oynar. Ayrıca, programlı hücre ölümünde (apoptoz) kullanılan bileşenlerden biridir. Normalde, sitosolik plazma membranında hapsedilmiş olarak bulunan fosfatidilserin, apoptoz esnasında hücredışı tek katmanına yer değiştirir. Hücre yüzeyinde açıkta kalan PS, çevredeki makrofaj gibi hücrelere sinyal gönderir ve bu şekilde hücrenin parçalanmasına katkıda bulunur. Yüzey plasmon rezonans (SPR), moleküller arası etkileşimlerin araştırılmasında ve kimyasal ve biyolojik analitlerin tespit edilmesinde kullanılan optik bir cihazdır. SPR cihazının çalışma prensibinin temeli olan polarize ışık, yüzeyi altın kaplı bir prizmaya gönderildiğinde ışığın bir kısmı absorplanmakta, bir kısmı da yansımaktadır. Yansıyan ışığın şiddetinde maksimum kaybın gerçekleştiği açıya rezonans açısı denir. Metal yüzeyiyle temas halinde ortamın özelliklerinin değişmesi veya yüzeyde madde birikimi olması durumunda rezonans açısı değişmekte ve bu değişiklik yüzeyde olan değişikliklerin anlaşılmasında kullanılabilmektedir. Kuvars kristal mikroterazi (QCM-D), kütlesel değişiklikleri, bir elektrik sinyaline çevirebilen çok kullanışlı bir yaklaşımdır. QCM-D cihazının bünyesinde bulunan kuvars kristalin piezoelektrik özelliği çalışma prensibinin temelidir. Piezoelektrik etki, asimetrik bir kristalin elektrik potansiyelinin uygulanmasıyla deformasyona uğramasıdır. Kuvars kristaller mekanik olarak deforme olduğunda, yüzeyinde elektiriksel bir potansiyel oluşur ve uygun bir elektrik devresine bağlanırsa kristalin kütlesine ve şekline bağlı olan sabit bir frekansta titreşim yapar. Yüzeydeki kütle değişimleri, rezonans frekansındaki sapmaya dönüştürülerek yorumlanır. Rezonans frekansına ek olarak, yüzeye bağlanan katmanların viskoelastik özellikleri, enerji yitimi (D) parametresiyle ölçülür. ∆D değerindeki artış yüzeyde vizkoelastisitesi yüksek analitlerin bulunduğunu; bu değerdeki düşme ise yüzeyde daha katı (rijit) bir yapının oluştuğunu gösterir. Bu çalışmada, farklı kompozisyonlarda ve farklı konsantrasyonlarda lipozomlar üretilerek katı bir yüzeye bağlı lipit zar modeli (tBLMs) oluşturuldu ve yüzeye tutunum kinetiklerinin belirlenmesi için yüzey plazmon rezonans (SPR) ve kuvars kristal mikroterazi (QCM-D) yöntemleri kullanıldı. Lipozomları oluştururken 3 farklı fosfolipit molekülü kullanıldı (fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE) ve fosfatidilserin (PS)). Lipit kompozisyonunun, çift katmanlı lipit membranın viskoelastik özelliklerini etkileyeceği düşünüldü ve bu özellik QCM-D cihazı ile tanımlandı. tBLMs, çalışma grubumuzun optimize ettiği prosedüre göre oluşturuldu. Buna göre; altın kaplı SPR ve QCM yüzeyleri dimetil sülfoksitte (DMSO) çözünmüş 3, 3′-dithiodipropionic acid di(N-hydroxy succinimide ester) (DTSP) molekülü ile aktive edildi (DMSO 1mM). DTSP, altın yüzeye tiyol grubu ile kendi kendine bağlanan bir moleküldür ve sistemimizin birinci katmanını oluşturur. İkinci katmanın oluşturulmasında; fosfat kafasına polietilenglikol bağlanmış ve bu uçta bir amino grubu taşıyan bir fosfolipit molekülü (DSPE-PEG), DTSP kaplı yüzey ile inkübe edildi. Bu molekül, tBLMs ile yüzey arasına bir mesafe konulması amacı ile kullanıldı. Üçüncü ve son katman, farklı kompozisyonlarda ve farklı konsantrasyonlarda lipozomların yüzeye gönderilmesiyle oluşturuldu. Lipozomlar zwitteriyonik (çift kutuplu) (PC/PE) ve anyonik yapıda (PC/PS) ve farklı konsantrasyonlarda (90:10, 75:25, 50:50 ve tam tersi) olmak üzere, 100 nm gözenekli membranlar kullanılarak ekstrüzyon yöntemiyle oluşturuldu. İlk olarak, çalışma grubumuz tarafından adsorbsiyon kinetiği ve tBLMs oluşumu daha önce gözlenen PC lipozomların tBLMs oluşumuna etkisi gözlendi. Daha sonra, elde edilen veriler PC/PE ve PC/PS lipozomlarının tBLMs oluşumu üzerindeki etkisinin araştırılması için referans olarak kullanıldı. Zwitteriyonik PC/PE lipozomların araştırılması sırasında, PC lipozomlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek refraktif indeks artışı gözlemlendi. Elde edilen verilerin daha iyi yorumlanabilmesi için ayrıca QCM-D analizleri ile bütünleştirildi. 75PC/25PE ve PE lipozomlardan alınan QCM sonuçlarına göre, PE konsantrasyonu arttıkça ∆D değerinde artış ve ∆f değerinde düşüş gözlemlendi. Bu sonuçlar gösteriyor ki, artan PE konsantrasyonu lipozomların yüzeyde bozulmadan kalmasına yolaçmaktadır. Ayrıca, çift katman oluşumu daha düşük PE konsantrasyonunda daha avantajlıdır. Anyonik PC/PS lipozomların tBLMs oluşumu üzerindeki etkisi incelendiğinde, PC lipozomlara göre oldukça yüksek refraktif index değerlerinin alındığı görüldü. Buna ek olarak, 75PC/25PS ve PS lipozomların QCM-D tekniği ile ölçümleri gerçekleştirildi. QCM-D sonuçlarına göre, lipozom içeriğindeki PS miktarı arttıkça büyük miktarlarda ∆D değerinde artış ve ∆f değerinde düşüş olduğu görüldü. Buna ek olarak, yüzeyde bağlanmadan kalan lipit moleküllerinin uzaklaştırılması için yapılan yıkama sonrasında ∆f ve ∆D sinyallerinde değişim olmadığı gözlendi. Yıkama sırasında frekanstaki artma lipozomların yüzeye yayıldığını ve içinde hapsolan suyun sistemden uzaklaştığını göstermektedir. Bu durumda, yıkama sonrasında frekansta değişimin olmaması ve ∆f-∆D değerlerinin beklenenden çok yüksek olması, lipozomların yüzeyde bozulmadan kaldığını belirtir. PC/PS lipozomların yüzeye yayılmasını ve tBLMs oluşumunu tetiklemek amacıyla yıkama sonrasında yüzeye % 70 etanol çözeltisi gönderildi ve etkisi SPR ile gözlendi. Fakat bu koşullarda yüzeydeki lipozomların tamamen yıkanmadığı gözlemlendi. Lipozom içeriğinden farklı olarak ayrıca lipozom boyutunun sistem üzerindeki etkisi de SPR cihazı kullanılarak incelendi. Bunun için, 50 nm çaplı 90PC/10PE ve 75PC/25PE lipozomlar kullanıldı. Sonuç olarak, her iki konsantrasyonda da lipozomların yüzeye gönderildiği sırada refraktif indekste artış olduğu, fakat daha sonra yıkama yapılmamasına rağmen refraktif indeksin ilk baştaki değere düştüğü gözlendi. Lipozom boyutunun yarıya düşürülmesinin lipozomların yüzeyle etkileşmesine rağmen bu etkileşimin çok kararlı olmamasına ve büyük ihtimalle elastisitesi daha az olan bu lipozomların yüzeye yayılmayarak hızla yıkanmasına yol açtığı düşünüldü.

Biological membranes are vital structures for cell life. Because of the complexity of biological membranes, it is very important to develop model membrane systems to study membrane components. Tethered lipid bilayer membranes (tBLMs) on planar surfaces provide an important media to mimic the lipid bilayer membrane in vitro. tBLMs can be used for applications such as biosensors or as a model system to study the structure and function of biomembranes and membrane proteins. Techniques such as surface plasmon resonance (SPR) and quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D) provide important information about adsorption kinetics of liposomes on the surface by using refractive index and dissipation (∆D) -and frequency (∆f) change values. In addition, ∆D and ∆f values allow determining viscoelastic properties of lipid components on the surface. In this work, the properties of tethered lipid bilayer membranes (tBLMs) constructed by different phospholipids (saturated phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) and phosphotidylserine (PS)) were studied and the whole process was followed by SPR. Lipid composition is expected to affect the bilayer properties like viscoelastic properties. This characteristic was determined by the help of QCM-D. tBLMs were formed according to the procedure optimized in our group. In order to construct tBLMs, either SPR gold covered slides or QCM gold covered crystals were activated with 3, 3′-dithiodipropionic acid di(N-hydroxy succinimide ester) (DTSP) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, 1mM). DTSP self-assembled on Au surfaces via its thiol groups. 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino poly ethyleneglycol)-2000] (DSPE-PEG) was then incubated with DTSP covered surfaces to form second layer on the surface and it was attached on it to serve as tethers for the tBLMs. To construct final layer, liposomes with different composition and different compounds (PC/PE and PC/PS: 90:10, 25:75, 50:50 and vice versa) were produced by the help of an extruder using 100 nm membranes and spread over the modified surface. PC/PE liposomes showed higher refractive index and ∆D and ∆f values than PC liposomes. This states that, increasing PE concentration affects membrane fluidity and led liposomes to stably attach to the surface without forming bilayer, whereas bilayer formation was more favored in lower PE ratios. Likewise, adding PS to PC liposomes caused the formation of intact multi-vesicles layer on the surface. This can be predicted from SPR and QCM-D results, because refractive index value of PC/PS liposomes was significantly higher than PC and PC/PE liposomes and ∆D and ∆f values increased by adding more PS to PC liposomes. There was no change in frequency values even after rinsing. In addition, 70% of ethanol solution was used to trigger vesicle fusion on 25PC/75PS liposomes. Unfortunately, the whole unattached lipids were washed off from the system at this concentration. Additionally, the effect of vesicle size on the formation of tBLMs was investigated. Fot this, 50 nm diameter of liposomes (90PC/10PE and 75PC/25PE) were prepared. Decreasing vesicle size from 100 nm to 50 nm affected vesicle adsorbtion to the surface negatively. In conclusion, the phospholipid content of liposomes have a great impact on the behavior of liposomes and different parameters like the size, fluidity and interaction with different ions affect this behavior. Since the cell membrane of different tissues have different compositions, these parameters should be investigated in more detail.
The Effect Of Liposome Phospholipid Content On The Formation Of Tethered Lipid Membranes
Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2012
Keywords: katı bir yüzeye bağlı lipit membran modeli; yüzey plasmon rezonans; kuvars kristal mikroterazi; fosfatidilkolin; fosfatidiletanolamin; fosfatidilserin; Tethered lipid bilayer membranes; surface plasmon resonance; quartz crystal microbalance; phosphatidylcholine; phosphatidylethanolamine; phosphotidylserine