Multipl Skleroz Klinik Alt Tiplerinde Moleküler Yolakların Ve Biyobelirteçlerin Araştırılması - Avşar, Timuçin (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015)
Multipl skleroz (MS) merkezi sinir sisteminde (CNS) nöroenflamasyon ve nörodejenerasyon ile karakterize, otoimmün kökenli olduğu kabul edilen, enflamatuvar, demiyelinizan bir hastalıktır. MS patojenezinde dolaşım sisteminde oto reaktif hale gelen bağışıklık sistemi hücrelerinin kan beyin duvarını (BBB) aşarak ya da CNS’de otoimmun hale gelen çeşitli hücrelerin nöronları çevreleyen myelin kılıfa saldırması görülmektedir. Nöronların ve daha ileri seviyelerde oligodendrosit hücrelerin yıkılması CNS’de farklı bölgelerde ve farklı zamanlarda lezyonların oluşmasına neden olmaktadır. Bu lezyonlarla ilişkili olarak gelişen demiyelinizasyon ve aksonal dejenerasyon MS’deki nörolojik engellilikten sorumlu olarak kabul edilmektedir.  MS’in etiyolojisi tam olarak bilinmemekle birlikte genetik ve çevresel risk faktörlerinin etkileşimiyle kompleks kalıtım paterninde ortaya çıktığı en yaygın görüştür. Genç erişkinlerde nontravmatik nörolojik hastalıklar arasında özürlülüğe yol açan en önemli hastalıktır. Kronik, nöroenflamatuvar, nörodejeneratif bir hastalık  olarak tanımlanan Multipl skleroz’un (MS), kompleks patojenezi ve farklı prognozları ile birlikte çeşitli klinik alt tipleri bulunmaktadır. Bu alt tipler hastalığın ilerleyişine ve semptomların ya da radyolojik bulguların ortaya çıkma sıklığına bağlı olarak farklı isimlerle sınıflandırılmaktadır. Klinik izole sendrom (CIS), yineleyici – düzelen MS (RRMS), birincil ilerleyen (PPMS) ve ikincil ilerleyen (SPMS) MS’in ana klinik alt tipleri olmakla birlikte MS’in farklı formlarına benzeyen fakat ortaya çıkışı ve diğer klinik parametrelere bağlı olarak farklı MS varyantları da bulunmaktadır. MS’in klinik alt tipleri arasında geçişler de görülebilmektedir. Farklı klinik alt tipleri, patojenezinde farklılıklar ve hastalığın kompleks yapısı göz önünde bulundurulduğunda, MS’in tanı ve prognozunun da ne kadar karmaşık olduğu görülmektedir. Bu nedenle hastalığın tanı ve prognozunda kullanılabilecek biyobelirteçlere ihtiyaç duyulmaktadır. Biyobelirteçler, normal biyolojik süreçleri, hastalık süreçlerini, veya ilaç yanıtlarının göstergeleri olarak, nesnel, objektif ölçülebilen ve değerlendirilebilen özellikleri taşıyan, bağımsız biyolojik moleküller ve görüntüleme simgeleri olarak tanımlanırlar. Biyobelirteçler ayrıca hastalıkların biyolojik  mekanizmalarının çözümlenmesinde de önemli rol oynarlar. Özellikle MS gibi klinik ve genetik heterojenite gösteren kompleks hastalıklarda hastalığın klinik alt tiplerinin birbirinden ayırt edilmesinde, farklı ilaçlara verilebilecek cevapların önceden anlaşılabilmesinde ayırıcı biyobelirteçlere ihtiyaç vardır. Farklı alt tiplerle ilişkilifarklı biyobelirteçlerin yer aldığı moleküler yolakların ya da protein – protein ilişkilerinin ortaya çıkarılması da hastalığın moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına yardımcı olacağı gibi, tanı ve prognozun yanı sıra tedavi etkinliğinin de artırılabilmesine olanak sağlamaktadır.  Bu çalışmada amaç MS alt tiplerine ait BOS örneklerinde, proteomik ve biyoinformatik yaklaşımlarla elde edilen protein biyobelirteçleri kullanılarak, farklı MS alt tiplerinin etiopatojenezinde rol alan moleküler yolakların ortaya konulmasıdır. Bu amaçla ilk olarak farklı klinik alt tiplerdeki aday protein biyobelirteçler, kontrol örnekleri ile yapılan kıyaslamalar ile ortaya konularak, proteilerin ifadelenme seviyeleri belirlenmiştir. Daha sonra, bu proteinler ve ifadelenme oranları kullanılarak PANOGA (Pathway and Network-Oriented GWAS Analysis) web ara yüzü ile KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) moleküler yolakları, biyoinformatik analizler ile belirlenmiştir. Bu yolaklarda yer alan diğer ilişkili proteinler belirlenerek hedef genler ve proteinler ortaya konulmuştur. Genom seviyesinde biyobelirteçlerin ortaya konulabilmesi için de ailesel MS olgularında genom boyu bağlantı (linkage) ve ilişkilendirme (association) çalışmalarında da hastalık ile ilişkili genetik varyantlar ve kromozom bölgelerinin belirlenmesi sağlanmıştır. Proteomik ve genomik verilerin karşılaştırılması ile elde korelasyon gösteren protein ve genlerin MS patojenezindeki rolleri göz önüne alınarak açığa çıkarılması hedeflenmiştir. Proteomik çalışmalarda 65 CIS, 72 RRMS, 42 ilerleyici MS (PMS) (PPMS ve SPMS birlikte) ve 42 kontrol örneğine (sağlıklı kontroller ve diğer nörolojik hastalıklara sahip hastalardan elde edilen örnekler) ait beyin omurilik sıvısı (BOS) ve serum kullanılarak her bir örnekten protein izolasyonu ve saflaştırılması yapıldı. 2D-PAGE (iki boyutlu jel elektroforezi) analizi ile en az 2 kat farklı miktarda ifadelendiği tespit edilen protein spotlarını belirlemek üzere farklı klinik alt tipler ve kontrollerle karşılaştırılmıştır. Tüm protein spotlarının kontrollerle karılaştırıldığında kat değişimleri belirlenerek listelenmiştir. Tüm protein spotları jellerden çıkarılarak kütle spektrometresi için hazır hale getirilmiştir. Matriks assited laser desorption ionization – time of flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS) analizi yapılarak spotların ait olduğu peptit dizileri ve proteinlerin isimleri tanımlanmıştır.  Genom boyu bağlantı ve asosiasyon çalışmaları için 28 farklı ailesel MS örnekleri toplanmıştır. Bu ailelerden bağlantı analizi için en uygun 10 aile seçilmiştir. Bu aileler MS tanısı almış 19 hasta ve 17 sağlıklı bireyden oluşmaktadır. Toplam olarak bu ailelerden 36 örneğe mikrodizin çalışması yapılmıştır. Aileler, birinci derece yakınlarında MS tanısı almış hastalar ve en az 1 sağlıklı birey içeren ailelerden oluşmaktadır. Mikrodizin çalışması için Illumina CytoSNP 300K SNP genotiplendirme çipleri kullanılmıştır. Elde edilen ham veriler hem bağlantı analizleri için hem de ilişkilendirme çalışmaları için kullanılmıştır. Aileler içerisinde de bağlantı analizi yapmak için, parametrik olmayan bağlantı (NPL) skoru, SimWalk multipoint NPL analizi ile 3118 belirteç üzerinde ve ortalama 1 cM aralıklarla incelenmiştir. Sonrasında ise, detaylı haritalama ile daha yüksek çözünürlükte analiz yapıldı ve NPL değeri 1.8 üzerinde olan kromozomal bölgeler elde edildi.  GWAS analizi için ailele MS örneklerinde birbiri ile akraba olmayan 11 MS hastası belirlenerek ve yine birbiri ile akrabalık ilişkisi bulunmayan 60 sağlıklı bireyle karşılaştırma yapılmıştır. Sağlıklı bireylerin mikrodizin analizlerinde de aynı Illumina çipleri (300K) kullanılmıştır. Biyoinformatik analiz için Golden Helix® SNP & Variation Suite (SVS) programı kullanılmıştır. Yapılan analizlerde ilk olarak 298114 genom boyu SNP verisi farklı özelliklerine göre filtreleme işlemine tabi tutulmuştur. Kalite ve kantitatif filtrelemeler sonucunda 129547 SNP belirteçi hasta ve sağlıklılarda karşılaştırılmıştır.  Proteomik çalışmalarda, MS klinik alt tipleri ve kontroller arasında yapılan karşılaştırmalarda kontrollere göre istatiksel olarak anlamlı miktarda farklılık gösteren 151 protein tespit edilmiştir. Bu proteinlerden literatürde daha önce MS ile ilişkilendirilmiş olanlar ve ilk kez tespit edilenler listelenmiştir. KEGG yolak analizi sonucunda da, farklı miktarlarda ifadelenen protein biyobelirteçleri kullanılarak,  hastalık grupları arasında ortak ve alt gruplara özgü moleküler yolaklar ortaya çıkarılmıştır. Bunlardan renin-angiotensin system (RAS) ve complement and coagulation cascade  (CCC) yolakları tüm MS alt gruplarında ortak olarak kontrol grubuna göre artmış bir aktivite göstermektedir (p

INVESTIGATION OF MOLECULAR BIOMARKERS IN MULTIPLE SCLEROSIS CLINICAL SUBTYPES
Investigation Of Molecular Biomarkers In Multiple Sclerosis Clinical Subtypes
Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015
Thesis (PhD) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2015
Keywords: Multipl Skleroz; Biyobelirteç; Moleküler Yolak; Tanı; Prognoz; Tuz Metabolizması; Multiple Sclerosis; Molecular Pathways; Diagnosis; Prognosis; Salt Metabolism