Ef-tu Proteininde Gtp Hidroliz Mekanizması - Başaran, Ayla (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015)
Protein sentezinin her aşamasında ribozom, uzama faktörü olarak tanımlanan pek çok GTP hidroliz enzimine ihtiyaç duymaktadır. Protein biyosentezin doğruluğu Uzama Faktörü - Tu sayesinde gerçekleşmekte olup EF-Tu olarak bilinen molekül doğru amino asidin ribozoma getirldiğini temin eder. EF-Tu protein biyosentezini katalizleyen GTPazlardan biridir ve aminoacyl-tRNA'yı ribozoma getirmekten sorumludur. Aminoacyl-tRNA GTP ile kompleks oluşturan EF-Tu'ya bağlanır ve böylece EF-Tu•GTP•aa-tRNA üçlü kompleksini oluşturur. Protein sentezinde aa-tRNA'ya ait anti-kodon ve mRNA'ya ait kodon eşleşme koşulu sağlandığında seri halinde gerçekleşen olaylar GTP hidrolizini tetikler. GTP'nin GDP'ye hidrolizi EF-Tu da konformasyonel değişikliklere neden olur ve EF-Tu aa-tRNA'yı serbest bırakarak EF-Tu•GDP kompleksi ribozomdan ayrılır. Bakterilerden ökaryotlara kadar GTP bağlanma domain yapısı tüm translasyon GTPazların benzerdir ve GTP hidrolizi korunmuş switch I ve II ve p-loop olarak tanımlanan bölgelerindeki yapısal değişikliklerden kaynaklı olarak gerçekleşmektedir. Ayrıca translasyonel GTPazlar tüm canlılarda ribozomda aynı bölgeye bağlanmaktadır. Tüm canlılarda korunmuş bağlanma bölgesinin var olması ve yapısal benzerlikler ribozomun EF-Tu gibi GTPazlarda, GTP'yi aynı mekanizma ile aktive ettiğini düşündürmektedir. Ancak 1960 yıllarından itibaren devam eden çalışmalar mekanizma üzerideki sır perdesini net olarak kaldıramamıştır ve GTP hidroliz mekanizması moleküler düzeyde henüz aydınlatılamamıştır. Literatürde günümüze kadar yapılan deneysel ve hesapsal pek çok farklı çalışmada GTP hidrolizi ile ilgili olarak farklı mekanizmalar önerilmiştir. Fosfat hidroliz reaksiyonları için bazı çalışmalar asosyatif mekanizmayı önerirken diğer çalışmalar disosyatif mekanizmasını önermektedir. Genel olarak asosyatif mekanizma penta-koordine fosfor atomlu bir ara ürün ya da geçiş yapısı oluşumu olarak; disosyatif mekanizma ise ara ürün ya da geçiş yapısı olarak meta-fosfat iyonu oluşumu olarak tanımlanabilir. Literatürde var olan çalışmaların pek çoğu GTPazların GTP'yi, oluşan β – veya γ−fosfat negatif yüklerini nötralize ederek ve katalitik su molekülünü doğru bir şeklide konumlandırarak hidrolizlediğini önermektedir. Ras, Rab gibi diğer G proteinleri ile yapılan çalışmalarda elde edilen veriler incelenerek GTP hidroliz mekanizması aydınlatılmaya çalışılmaktadır. Heterotrimerik G proteinleri ile yapılan çalışmalarda ara ürün yapısının Switch II bölgesinde yer alan Gln204 ve Switch I bölgesinde yer alan Arg178 amino asitleri tarafından stabilize edildiği bildirilmiştir. Ancak Ras p21 gibi küçük GTPazlarda GTP hidrolizi Switch II bölgesinde Gln204 amino asidi yer almasına rağmen Switch I bölgesinde Arjinin amino asidi yer almadığı için farklılıklar göstermektedir. Ancak Ras p21 ile gerçekleştirilen yapısal çalışmalarda, ara ürün yapısının stabilize edilmesi sürecinde RasGAP'in Arg178 ile benzer konumda bulunan ve "Arjinin parmağı" olarak tanımlanan yan zincirini kullandığı rapor edilmiştir. Ras p21 de ara ürün yapısı Switch II de yer alan Gln61yan zinciri ile de ayrıca stabilize edilmektedir. EF-Tu Ras p21'e ait Gln61 ve Giα1'e ait Gln204'e benzer bir amino asite sahiptir. Bu amino asit E. coli'ye ait EF-Tu switch II bölgesinde belirlenen Histidine 84'tür (T. aquaticus ve T. thermophilus EF-Tu söz konusu olduğunda His85). Son yıllarda EF-Tu ile yapılan hidroliz çalışmaları His84 üzerinde yoğunlaşılımıştır. Histidinin reaksiyon sırasındaki görevi ile ilgili pek çok tartışmalı görev önerilmiştir. Bazı çalışmalar histidinin baz görevi üstlenerek katalitik suya ait protonlardan birini aldığını, bazıları ise asit görevi gördüğünü öne sürmüştür. Ancak yapılan pKa hesaplamaları histidinin baz görevi üstlenemeyeceğini ve aktif bölgede protonlu bulunduğunu göstermiştir. Bununla birlikte His84 ile ilgili ortaya atılan bir diğer öneri His84'ün katalitik merkeze girişinin hidrofobik kapı tarafından kontrol edilmesi olmuştur. Bu kapı Val20 ve Thr61 amino asitleri tarafından oluşturulmuştur. "Hidrofobik kapı" görüşüne göre kapı uygun şartlar sağlandığında açılmakta ve histidin aktif bölgeye girerek nukleofilik su ve GTP ile etkileşerek katalitik rolünü gerçekleştirmesine olanak sağlamaktadır. Kapı kapalı iken ise GTP hidrolizi gerçekleşememektedir. Ancak yapılan çalışmalarda böyle bir kapının var olmadığı ve Histidinin aktif merkezin dışında ve içinde serbest olarak hareket edebildiği gösterilmiştir. Son hesapsal çalışmalarda bazı bilim adamları His84 amino asidinin doğrudan bir katalitik etki göstermediğini, temelde hidrolizin p-loop bölgesi ile gerçekleştiğini öne sürmüştür. Ancak genel kabul His84'ün katalitik bir etki gösterdiği ve aktif bölgede ribozom tarafından uygun konumlandırıldığı ve bu şeklide GTP hidrolizinin başlatıldığı şeklindedir. Günümüze kadar EF-Tu için "Arjinin parmağı" arayışı sonuç vermemiş ve bu amino asidin hidroliz reaksiyonunda katalitik bir görev üstlenebileceği ihmal edilmiştir. E. coli'de Switch I bölgesinde yer alan Arg 58 amino asidinin (T. aquaticus ve T. thermophilus EF-Tu'da Arg59) Giα1 de Arg178 ile benzer bölgede olduğu görülmüştür. Ancak, bu kalıntının ribozoma bağlanmada rol oynadığı, katalitik etkisi olmadığı tespit edilmiştir. Bu bölgede yer alan bir diğer pozitif yüklü amino asit de Arg57'dir (E. coli'de Lys56). Bu amino asit ile ilgili az sayıdaki deneysel çalışmada katalitik bir işlevi olabileceği görülmüştür. Bu verilerin doğrultusunda bu tez çalışmasında EF-Tu'da tartışmalara neden olan GTP hidroliz mekanizmasının incelenmesi amaçlanmıştır. Mekanizmanın asosyatif veya disosyatif karakter gösterip göstermediği, proton transferinde tek bir su molekülünün veya iki su molekülün yer alıp almadığının tespit edilmesi için Gaussian 09 programında yer alan ONIOM metodu kullanılarak geometri optimizasyonları yapılmıştır. Çalışmalarda M06-2X fonksiyoneli ve MM için Amber ff03 (force field) güç alanı kullanılmıştır. Reaksiyon mekanizmasının incelenmesi için 3 farklı model oluşturulmuştur. GTP hidrolizinde katalitik rol üstlendiği düşünülen Histidine 85 ve yine daha önceden diğer G-proteinlerde tespit edilen "Arjinin parmağı" için Arg57 amino asitlerinin her birinin aktif bölgede olduğu 2 farklı model belirlenmiştir. Ayrıca her iki amino asidin aktif bölgenin dışında yer aldığı kontrol amaçlı bir model de oluşturulmuştur. Böylece ribozomun olmadığı ve His85 ve Arg57'nin katalizi başlatabilecek şekilde doğru olarak konumlandırılmadığı bir yapı oluşturulmuştur. Her 3 model için reaktan ve ürün geometrileri oluşturulmuş ve bunlar ONIOM metodu ile optimize edilmiştir. İlk aşamada yapılar mekanik embeding ile optimize edilmiş olup daha sonra elektronik embeding ile optimize edilmişlerdir. Optimizasyon çalışmaları ürün parametreleri ile gerçekleştirilmiştir ancak sonuçların tutarlılığın test edilmesi için optimizasyonlar reaktan parametreleri ile de yapılmıştır. Enerji olarak benzer sonuçlar elde edilmiştir ki bu durum sonuçlarımıza olan güvenilirlilik konusunda destek sağlamaktadır. 3 temel yapı için asosyatif geçiş yapıları oluşturulmuştur. Ayrıca mekanizmada tek veya çift su molekülünün proton transferinde rolünü aydınlatabilmek için 2 sulu yapılar da bazı modeller için oluşturulmuştur. Ancak yapılan enerji analizleri reaksiyonda ikinci suyun katalitik görev üstlenmesinin enerjiye çok fazla bir katkı sağlamadığı tespit edilmiştir. His85'in aktivasyon enerjisini yaklaşık 6 kcal/mol, Arg57'nin yaklaşık 12 kcal/mol azalttığı görülmüştür. Bu da her iki amino asidin da katalizde önemli rol oynadığını göstermektedir. Katalitik etkinin kısmen His85 ve Arg57'nin pozitif yükleriyle asosyatif mekanizma sırasında nükleofilik suyun GTP'ye proton vermesi sonucu oluşan OH- iyonunu stabilize etmelerinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Geleneksel dissosyatif mekanizmayı temsil edecek yapıların tespiti için farklı yaklaşımlar denenmiştir. Bunun için reaksiyonda olması beklenen ara ürünlerin tespit edilmesi için farklı yapılar oluşturulmuştur Bu ara ürünler geometri optimizasyonu sonucu ya reaktana ya da ürüne dönüşmüştür. Diğer bir deyişle, disosyatif mekanizmayı karakterize eden ara ürünler potansiyel enerji yüzeyinde yer almamaktadır. Kırılan ve oluşan bağ uzunluklarının sistematik bir şekilde değiştirilmesiyle yapılan bir potansiyel enerji yüzeyi taramasında da disosyatif mekanizmada oluşması beklenen H2O.PO3- kompleksinin, kırılan bağ uzunluğundan bağımsız olarak, hep çok yüksek enerjili olduğu görülmüştür. Dolayısıyla, en azından incelenen 3 model için, disosyatif mekanizmanın mümkün olmadığı anlaşılmaktadır. Optimize edilen ürün geometrilerinde GDP ve Pi arasında mutlaka bir proton bulunduğu görülmüştür. Bu proton negatif yüklü GDP ve Pi arasındaki elektrostatik itmeyi azaltmaktadır. His85'in aktif bölgede olduğu durumlarda proton hep GDP'nin üzerinde yer almaktadır. Arg57'in aktif bölgede olduğu ürün geometrilerinde proton ya GDP'de, ya da Pi'nin Arg57'ye yakın oksijeni üzerinde yer alabilmektedir. Her iki amino asidin da aktif bölgenin dışında olduğu ürün yapılarında ise proton ya GDP üzerinde, ya da Lys24'ten uzakta olan Pi oksijeni üzerinde bulunmaktadır.

Protein biosynthesis or translation is the process in which the information stored in the nucleotide sequence of messenger RNA (mRNA) is converted into the sequence of amino acids in a polypeptide. In all organisms, protein biosynthesis is driven on ribosomes which are macromolecular complexes composed of ribosomal RNAs and proteins. Several GTP (guanosine 5´-triphosphate) – hydrolyzing enzymes known as GTPases are important components in all stages of a protein synthesis. Elongation factor Tu (EF-Tu) is a member of G protein family, and as part of a ternary complex with GTP plays a critical function in translation by delivering aminoacyl-tRNA to the ribosome. Like other G proteins, the function of EF-Tu depends on whether GTP or GDP is bound, which means that the GTP hydrolysis is the critical step for the activity of the protein. It is known that from bacteria to higher eukaryotes the structure of the GTP-binding domain is similar in all translational GTPases. It was observed that GTP hydrolysis is dominated by conformational changes in the conserved Switch I and II regions. With analogy to other G-proteins one of the critical residues in EF-Tu which dominate the reaction is believed to be His85 but its key role in stabilizing the transition state (TS) is unclear. We also suggest Arg57 in Switch I region might be involved in the GTP hydrolysis reaction. The role of those residues is investigated in this study. Another critical issue is that the GTP hydrolysis or phosphate hydrolysis reactions in general can occur by an associative or dissociative pathway. The associative pathway can be described by the formation of an intermediate with a penta-coordinated phosphorus atom whereas the dissociative pathway can be described by the formation of a metaphosphate ion as an intermediate. GTP hydrolysis reaction of EF-Tu is modelled in this computational study by applying Quantum Mechanical/Molecular Mechanical (QM/MM) methods. Different model structures representing the associative or dissociative path of GTP hydrolysis have been optimised and the energy values have been compared in order to state the best mechanism. Our findings showed that in all tested models the proton has transferred to the GTP without any assistance of a second water molecule. It was observed that when either Arg57 or His85 are not present in the active site of EF-Tu, the negatively charged GDP and Pi molecules create a repulsive effect and the reaction shows an endothermic character. The presence of positively charged Arg57 or His85 in the active site appears to reduce the electrostatic repulsion between negatively charged GDP and Pi significantly and makes the reaction slightly exothermic. The present results indicated that Arg57 and His85 decrease the activation energy by ~12 and ~6 kcal/mol, respectively. All optimised transition structures have associative character. We have observed that the energy has increased at the points where the dissociative path is most probable to occur. A dissociative mechanism has been found to be unlikely, at least for the models studied.
The Gtp Hydrolysis Mechanism İn Elongation Factor-tu (ef-tu)
Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2014
Keywords: Yoğunluk fonksiyonu teorisi Kuantum mekaniği Yerel yoğunluk yaklaşımı Genelleştirilmiş gradyan yaklaşımı Hibrid fonksiyonel Uzama faktörü EF-Tu Guanozin trifosfat GTP Hidrolizi; Density function theory Quantum mechanics Local density approximation Generalized gradient approximation Hybrid functional Elongation factor EF-Tu Guanosine triphosphate GTP Hydrolysis