Ailevi Akdeniz Ateşi Hastalığında Mefv Varyasyonlarının, Ekspresyonunun Ve Pirin Seviyesinin Analizi - Sevinç, Neslihan (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016)
Ailevi Akdeniz ateşi (AAA) otozomal resesif olarak kalıtılan otoinflamatuvar bir hastalıktır. Periodik olarak tekrarlayan ateş, eklem göğüs ve karın ağrısı hastalığın belli başlı bulgularıdır. AAA hastalığı bir çok popülasyonda gözlemlenmesine karşın, hastaların büyük çoğunluğunu Akdeniz kökenli popülasyonlardan bireyler oluşturur. Hastalık özellikle, Türkler, Ermeniler, Araplar ve kuzey Afrika Yahudileri arasında yaygındır.  AAA hastalarında dönemsel olarak meydana gelen inflammatuvar ataklar çeşitli organlarda amiloid birikimine yol açabilmektedir. Bu durum hastalığın seyrinde ağırlaşmaya yol açmakta ve bireylerin hayat kalitesini ve ömrünü etkileyebilmektedir. Dolayısıyla hastalık prognozu organlardaki amiloid birikiminin engellenmesine bağlıdır. Anti-inflammatuvar bir ilaç olan kolşisin 1972 yılından bu yana AAA hastalığının tedavisinde kullanılmaktadır. Yapılan çalışmalar ilacın AAA hastalarında pediodik atakları ve amiloid oluşumunu engellediğini göstermiştir. Ancak, hastaların yaklaşık olarak %30-40‟ı ilaca kısmi cevap vermekte, %5-10‟u ise direnç göstermektedir. Buna ek olarak, hastaların %2-5’inde ilaca hassasiyet rapor edilmiştir. Bu nedenle, kolşisine alternatif olabilecek çeşitli biyolojik ajanların AAA hastalığının tedavisindeki rolü araştırılmaktadır. Akdeniz ateşi geni (MEFV) kromozom 16’da 13.3 bölgesinde bulunur ve 10 ekzondan oluşur. Bugüne kadar MEFV geninde 200’den fazla sekans varyasyonu rapor edilmiştir ve bu varyasyonlardan ekzonik bölgelerde yer alanların büyük çoğunluğu hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Hastaların %70’inden fazlasında yaygın olarak gözlemlenen varyasyonlar MEFV geninin ekzon 2 (E148Q, R202Q) ve ekzon 10 (M680I, M694V, M694I ve V726A) bölgelerinde bulunur. Buna karşın, hastalığın teşhisini kolaylaştırmak amacıyla MEFV geni üzerindeki patalojik varyasyonların taranması AAA’nın yaygın olarak gözlemlendiği popülasyonlardaki yüksek taşıyıcılık oranı nedeniyle kesin tanıda yetersiz kalabilmektedir. Bunun yanı sıra, MEFV geni üzerinde her hangi bir patolojik varyasyon saptanamayan, buna karşın tipik AAA kliniği gösteren hastalar da mevcuttur.  Bu durum, otozomal resesif geçiş gösteren kalıtsal Mendel hastalıklarında gözlemlenen modele uymamaktadır. Bu amaçla MEFV geninin ilişkili olabilecek epigenetik ve taranskiripsiyonel düzenleyici mekanizmalarını araştırdık. İlk bulgularımıza göre, MEFV geninin ekzon 2 bölgesinde meydana gelen metilasyon hücre çekirdeğinde, hücre kültürü modellerinde ve hasta lökositlerinde alternatif kırpılma sonucunda yeni bir varyant oluşmasına neden oluyor. Bu varyant daha sonra sitoplazmada protein izoformuna dönüştürülüyor.  MEFV geninin kırpılmamış formu 781 amino asitten (a.a.) oluşan pirin/marenostrin proteinini kodlar. MEFV-d2 (MEFV Δ2) ise MEFV genine ait alternatif kırpılma sonucunda exon 2 bölgesinin silinmesiyle oluşan bir izoform olup, 570 a.a. uzunluğunda bir protein kodlar. Buna ek olarak pirin proteinine ait başka izoformlar da tanımlanmıştır. Bu tez çalışmasında, AAA hastaları ve kontrollerde MEFV gen varyasyonlarının transkript ve protein seviyesi ile korelasyonu araştırılmıştır.  Daha önceki çalışmalar MEFV geninin dendritik hücreler, sinovyal fibroblastlar, nötrofiller, eozinofiller ve monositlerde ifade edildiğini göstermiştir. Farklı MEFV varyasyonlarını MEFV geninin transcript seviyesi ile ilişkilendiren çalışmalar mevcuttur. Yapılan bir çalışmada, AAA hastalarının mRNA seviyeleri sağlıklı bireylerden düşük bulunmuştur. Buna ek olarak, sağlıklı taşıyıcılarla karşılaştırma yapıldığında sağlıklı taşıyıcıların mRNA seviyesi orta düzeyde bulunmuş, bu da mutasyon sayısının mRNA miktarı ile ilişkili olabileceğini düşündürtmüştür. Ayrıca, mutasyonun bulunduğu gen bölgesine ve tipine göre de MEFV ekspresyonunun değişebileceği gösterilmiştir. M694V mutasyonu taşıyan bireylerde mRNA seviyesinin diğer hastalara oranla en düşük seviyede olduğu ve M694V mutasyon sayısındaki artışın bu oranı daha da düşürdüğü belirtilmiştir. Buna ek olarak E148Q mutasyonu taşıyan bireylerin mRNA seviyesinin diğer hastalardan daha yüksek olduğu gösterilmiştir.  Grubumuz tarafından yayınlanan daha önceki çalışmalarda da MEFV taranskript seviyesinin AAA hastalarında düştüğü gösterilmiş, buna karşın alternatif kırpılma sonucunda ekzon 2’nin silinmesiyle oluşan transkript seviyesinin kontrollere oranla hastalarda daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Ancak pirin proteininin AAA hastalığında ve inflamasyondaki rolü henüz aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, yürütülen çalışmada hasta-kontrol çalışması yönteminden yararlanılarak farklı genotiplere sahip AAA hastalarında MEFV geninin ifadesinin ve pirin protein seviyesinin araştırılması amaçlanmaktadır. Bu doğrultuda, 69 AAA hastası ve 28 sağlıklı kontolün genotiplerini belirlemek amacıyla MEFV geninde varyasyon analizi yapılmıştır. 69 AAA hastasından 8’inde (%11) her hangi bir patalojik varyasyon bulunamamıştır. Buna karşın 30 (%43) hastada ekzon 2 bölgesinde varyasyon bulunmuş, 31 (%44) hastada ise ekzon 10 bölgesinde patalojik varyasyonlar tespit edilmiştir. MEFV geninin farklı transkriptlerinin ifadesi ekzon 1-3, ekzon 2-3 ve ekzon 4-5 bağlantı bölgelerini hedefleyen primerler kullanılarak Kantitatif- gerçek zamanlı PZR (Q-PCR) yöntemi ile araştırılmıştır. Farklı genotiplere sahip hastalar ve sağlıklı kontrollerin pirin seviyelerini karşılaştırmak amacıyla ise bireylerin tam hücre lökositleri izole edilerek, bu hücrelerde anti-pirin antikoru kullanılarak western blot analizi yapılmıştır.  Elde edilen sonuçların yarı kantitatif analizi Image-Lab yazılımı ile hacim densitometre yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Daha önceki çalışmalardan farklı olarak, yürütülen çalışmada MEFV transkript seviyesinin hasta ve kontoller arasında değişmediği bulunmuştur. Bugüne kadar yürütülen çalışmaların planlanmasındaki farklılıklar ve farklı çalışmalarda MEFV geninin farklı bölgelerinin hedeflenmesi, MEFV geninin farklı transkriptlerinin hedef alınmasına yol açmış, bu durum da çalışmalarda genin ifadesi ile ilgili sonuçların farklılık göstermesiyle sonuçlanmış olabilir. Ancak, daha önceki çalışmalarda sınırlı sayıda örnek ile çalışıldığı, buna karşın yürütülen tez çalışmasında daha önceki çalışmalara oranla daha fazla örnek ile çalışıldığı göz önünde bulundurulmalıdır.  Yürütülen çalışmada gen ifadesinin yanı sıra pirin protein seviyesi de 48 hasta ve 24 sağlıklı kontrolde araştırılmış ve AAA hastası bireylerde pirin miktarında kontrollere oranla anlamlı bir artış gözlemlenmiştir (p= 0,0092). Hastalarda gözlemlenen yüksek pirin seviyesinin periodik inflamatuvar ataklara neden olan AAA hastalığının fenotipinin oluşmasında etkili olabileceği düşünülmektedir. Elde edilen bulgular pirin proteinin imflamasyonu tetikleyici rol oynadığı yönündeki hipotezi destekleyici niteliktedir. Sunulan tez çalışmasında, MEFV geninin transkript seviyesi ile pirin proteinin seviyesi arasında bir korelasyon bulunamamıştır. Bu bulgular AAA hastalığının oluşumunda post-trasnkripsiyonel mekanizmaların etkili olabiliceğini düşündürmektedir. İleriki çalışmalarda, transkript ve protein seviyesinde hücre alt tipleri ayrıştırılarak analizlerin tekrarlanması, bunun yanı sıra transkript ve protein izoformalarının ayrı ayrı incelenmesi MEFV geninin hastalık ile ilişkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. AAA hastalarında atak dönemlerinde yoğun belirtiler gözlemlenir. Bu nedenle, ataklı hastaların çalışmaya dahil edilmesi hastalık patogenezi hakkında daha fazla bilgi sağlayacaktır.

Familial Mediterranean Fever (FMF) is an autosomal recessively inherited autoinflammatory disease which is characterized mainly by periodic attacks of recurrent fever, serotisis, joint, chest, and abdominal pain. The vast majority of FMF patients belong toTurkish, Armenian, Arab, or North African Jew. Mediterranean fever gene (MEFV) is located on the short arm of chromosome 16 at position 13.3 and consists of ten exons. More than 300 sequence variations have been reported in the gene and majority of exonic variations are associated with the disease. The most common variations that appear to be present in more than 70% of patients are located in exon 2 (E148Q, R202Q) and in exon 10 (M680I, M694V, M694I, and V726A) of the MEFV gene. However, screening of MEFV pathological variations in patients to improve diagnosis is not enough to definitely define FMF in mentioned populations with high prevalence, due to high carrier rate of the variations. Moreover, there are FMF patients showing typical clinical manifestation who do not  have any identified MEFV pathological variation. This finding is in contradiction with a pattern that is observed in a typical autosomal recessive Mendelian inherited disease.  To this end we have been studying the transcriptional and related epigenetic regulation of the MEFV gene. Our initial findings suggested that exon 2 methylation of the MEFV gene produces an alternatively spliced variant, and in cell culture models and in patients leucocytes which further translates into protein isoform in the cytoplasm.  Full-length MEFV encodes Pyrin/Marenostrin protein formed by 781 amino acids (a.a.). MEFV-d2 (MEFV Δ2) is one of the isoform of MEFV gene encoding 570 a.a. protein in length and it is formed by removal of exon 2. There are also other identified pyrin isoforms. In this thesis, we wanted to study and correlate MEFV gene variations with its transcript and protein levels in FMF patients and controls. Previous studies have shown that MEFV gene is expressed in dendritic cells, synovial fibroblasts, neutrophils, eosinophils and cytokine activated monocytes. Recently, it has been shown that MEFV gene expression level is associated with type of the MEFV mutations. It has been shown that FMF patients have lower mRNA level than healthy controls and in healthy carriers level of the MEFV transcripts were intermediate which indicates association of number of mutations with abundance of mRNA. Furthermore, type of the mutations was shown to alter level of MEFV transcript.  It was found that M694V mutation, which leads to severe disease, has lowest mRNA expression when compared with other mutations and number of M694V mutations affects the mRNA level in the manner of decreasing. It was also shown that in comparison with other mutations, mRNA expression level is highest in the patients carrying E148Q mutation giving rise to milder disease. Our previous published studies have also shown that MEFV transcript levels overall decreases in FMF patients, however exon 2 alternatively spliced transcript increases compared to controls. Nonetheless, the role of pyrin in the disease and inflammation has not been clarified yet. In this context, the aim of the study is to analyze MEFV gene expression and pyrin levels in FMF patients having different genotypes using case-control methodology. To this end, MEFV variation analysis was conducted in 69 FMF patients and 28 healthy controls in order to determine genotype of the study group. 8/69 (11%) of the FMF patients have no pathogenic variations; whereas 30 (43%) patients have variations within exon 2 region of the gene, and 31 (44%) patients have pathogenic variations within exon 10 region of the gene, which are specified as pathogenic. Expression of alternatively spliced MEFV transcripts were also quantified in leukocytes of all samples using SYBR-Green based quantitative Real-Time PCR method with 3 sets of primers targeting the junction of exon 1-3, exon 2-3, and exon 4-5. In order to establish differences of pyrin levels between the patients having different genotypes and healthy individuals, western blot analysis was also conducted with anti-pyrin antibodies using proteins isolated from leukocytes. Semi quantitative analyses of the gels were performed with volume densitometry using Image Lab Software. In contrast to previous studies, no differences in the level of MEFV gene expression have been found between patients and healthy controls. Variations in the study design and amplified regions of the gene imply that differential expression of splice variants in different studies may lead to variable results about expression pattern of the gene. However, it is also important to note that sample size of the present study is larger than the previous studies. In order to study the role of MEFV gene at the level of pyrin expression, pyrin levels of 48 FMF patients, mostly with pathological variations, were also compared with 24 healthy individuals and significantly higher pyrin levels were found in FMF patients (p=0,0092) indicating high level of pyrin protein might lead to disease phenotype in FMF patients having recurrent inflammatory attacks. The findings in this thesis support the hypothesis for the function of pyrin as an activator of inflammation. In the present study, no correlation between MEFV transcript level and pyrin level was found. This finding was thought that post-transcriptional modifications might have a role in FMF. All together, the present study suggests that MEFV gene might contributes FMF phenotype at protein level. As a future direction, cell type specific analysis should be applied at both transcript and protein levels; additionally, transcript and protein isoforms should be studied separately. Furthermore, including patients in the study during in attack periods and investigation of other genetic and epigenetic factors will lead us better understanding about pathogenesis of FMF.
Analysis Of Mefv Variations, Expression And Pyrin Levels In familial Mediterranean Fever Disease
Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2016
Keywords: FMF; MEFV; Ailevi Akdeniz Ateşi; AAA; pirin; FMF; MEFV; Familial Mediterrenean Fever; pyrin