Multiple Skleroz Alt Tiplerinin Ayrımı İçin Notch Sinyal Yolağı Proteinlerinin Biyobelirteç Potansiyellerinin Araştırılması - Öztürk, Zeynep (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016)
Multiple Skleroz (MS), oto-inflamatuar, bağışıklık sistemi aracılı, nöronların miyelin kılıf ve akson hasarları sonucu nörodejenerasyon gösteren bir merkezi sinir sistemi (MSS) hastalığıdır. Bu hasarların sinir sistemi iletişimine zarar vermesi sonucu bir çok semptom ve işaret ortaya çıkmaktadır. MS beyaz madde denilen kısımda meydana gelen plaklarla karakterize edilmektedir ve genellikle genç yetişkinlerde görülür. MS hastalığının sebepleri kesin olarak bilinmemekle beraber, son çalışmalar bağışıklık sistemi aracılı sinir sistemi inflamsayonunun birinci basamak olduğu yönünde güçlü kanıtlar sunmaktadır. İnflamasyon periferal sistemde başlar, kan-beyin bariyeri hasarları nedeniyle inflamasyon elementleri ( Th1, Th17, CD8+, B hücreleri ve makrofajlar) MSS’ne girer ve buradaki mikroglia hücrelerini, demiyelinizasyon süreçlerini ve aksonal hasarlanmayı başlatır. Kan-beyin bariyerinin hasarlanma nedenleri ve MSS’ne hücresel infiltrasyonun nedenleri henüz tam net değildir. MS heterojen bir klinik gösterime ve sürece sahiptir, maalesef efektif bir tanı testi henüz bulunamamaktadır. Bu nedenle, hastalığın hangi basamakta olduğuna, verilen ilacın oluşturduğu cevaba ve genel hastalık ilerleyişine dair kesin bir sonuca varmak zordur. MS’in geniş bir klinik spektrumu vardır: Radyolojik İzole Sendrom (RIS) olarak ya da Klinik İzole Sendrom  (CIS) olarak başlar ve Atak ve İyileşmelerle Giden (RRMS), primer/skonder İlerleyen (PP/SP MS) olarak devam eder.  Temel olarak MS’in tanısı manyetik rezonans görüntülerine (MRI) ve klinik belirtilere dayanarak yapılmaktadır. Klinikte laboratuvar temelli tanı testi olarak beyin omurilik sıvısının (BOS) oligoklonal bantlarının analizi tanı kriteri olarak kullanılmaktadır. Bireye özgü olarak hastalık patolojisinin tespit edilmesi gereklilik arzetmektedir ve bu nedenle güvenilir biyobelirteç araştırmaları devam etmektedir. Biyolojik işaretler ya da “biyobelirteçler” biyolojik süreçleri ya da tedavi amacıyla kullanılan ajanlara oluşan cevapları objektif olarak tespit etmek amacıyla ölçülen moleküllerdir. Bugüne kadar MS alttiplerini ayırt etmek ve hastalığın tipleri arasındaki geçiş risklerini belirtebilmek için, hastalığın heterojenliğinden dolayı tek bir biyobelirteç belirlenmesi mümkün olmamıştır fakat klinikte koleksiyon halinde biyobelirteç kullanımı görülmektedir. Özellikle PPMS formunun ayırt edilmesi ve tanılanması için bioyobelirteçlere öncelikle ihtiyaç duyulmaktadır. Tedavi amaçlı kullanılan ilaçların oluşturduğu cevabın tayin edilmesi de büyük önem arz etmektedir. Bugüne kadar kullanılan ve geliştirilen ilaçların çoğunluğu immune sistemi baskılamaya yönelik olmuştur. Grubumuz önceki çalışmasında, İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Nöroloji Bölümünden elde ettiği hasta grubu ile bir proteomik çalışma gerçekleştirmiştir. Bu çalışma sonucunda MS ile ilişkilendirilen patolojik yolakların tespiti yapılmıştır. Bu yolaklar; renin-anjiyotensin, aldosteron ile düzenlenen sodyum geri emilimi, komplement-koagülasyon ve Notch sinyal yolağıdır. Notch sinyal yolağı diğer alttiplere göre PPMS hastalarında daha aktif olarak bulunmuştur. Bu yolak, kompleks organizmalar arasında evrimsel süreçte korunmuş ve myelinizasyon/demiyelinizasyon, hücre-başkalaşım regülasyonu, doku spesifik hücrelerin farklılaşması ve gelişim süreçlerinin ayarlanmasında önemli rollere sahip olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle myelinizasyon/demiyelinizasyon süreci ile bağlantısından dolayı Notch sinyal yolağı ve proteinleri MS’de biyobelirteç adayları olarak düşünülmüştür. Olgun oligodendrisit hücre oluşumu miyelin üretimi için önemlidir ve öncül hücrelerden bu olgunlaşmayı control eden en önemli yolak Notch sinyal yolağıdır. Bu çalışma sayesinde hem biyolbelirteç araştırmaları için hem de ilaç geliştirme çalışmaları için yeni aday yolaklar literature kazandırılmıştır.  Bundan dolayı, bu çalışmada Notch sinyal yolağı proteinlerinden “Notch1, Nicastrin, Numbl ve Pen-2” araştırılmak amacıyla seçilmiştir. Notch1 membrana bağlı bir reseptördür ve sinyal aldığında Notch yolağının aktifleşmesini sağlamaktadır. Nicastrin ve Pen-2 ise gamma-sekretaz enzim kompleksinin alt gruplarıdır ve Notch1’in sinyal bağlamasından sonar gerekli kesim işlemlerinde rol alırlar. Numbl ise Notch1 proteininin yolağı aktifleştirmesinde negative rol almaktadır, bir baskılayıcı proteindir. Çalışma grubu McDonald’s (2010) kriterlerine göre tanılanmış 30 RRMS, 30 CIS, 24 PPMS hastası ve 20 diğer nörolojik hastalar/sağlıklılar kontrol olarak belirlendi. Bu çalışmada amacımız Notch1, Nicastrin, Numbl ve Pen-2 proteinlerinin MS alttiplerinde olası biyobelirteç olasıklarının incelenmesidir. Bu proteinlerin konsantrasyonları ELISA ve western blotting teknikleri ile çalışma grubunun serum ve BOS sıvılarında ölçülmüştür. ELISA sonuçlarına gore serumda Notch1 seviyesi control ve gruplar arasında önemli farklılık göstermektedir. Karşılaştırmalara göre kontrol ve CIS; kontrol ve RRMS; CIS ve PPMS; RRMS ve PPMS çok anlamlı farklılık göstermiştir  (p≤0.0001). Serum ve BOS’da Nicastrin seviyelerinde anlamlı bir farklılık çıkmamıştır. BOS Numbl seviyelerinde control ve CIS (1999,25 pg/μl; 1617,27 pg/μl, p≤0.01), control ve RRMS (1527,85 pg/μl, p≤0.001), CIS ve PPMS (1947,44,p≤0.01) ve RRMS ile PPMS (p≤0.001) anlamlı farklılıklar göstermiştir. Serum Numbl seviyelerinde ise control ve CIS (1899,56 pg/μl; 2814,36 pg/μl) ile control ve RRMS 7,082 pg/μl) p≤0.01), CIS ve PPMS (1804,48 pg/μl) ile RRMS ve PPMS (p≤0.05) anlamlı farklılıklara sahiptirler. BOS’da Pen-2 seviyeleri arasındaki farklar control ve CIS (2410,05 pg/μl, 1821,05 pg/μl) ile control ve RRMS (1578,55 pg/μl) için (p≤0.0001), control ve PPMS için (2065,72 pg/μl, p≤0.05); RRMS ve PPMS için ise (p≤0.001) derecesindedir.  Daha sonar bu sonuçlarla klinik hasta bilgileri arasında korelasyon testleri yapılmıştır. Pearson Korelasyon testi olası tüm bağlantılar düşünülerek serum ve BOS sonuçları ile kıyaslanmıştır. Test sonucunda anlamlılık derecesinde ilişki sadece BOS sonuçlarında bulunmuştur. Protein konsantrasyonları ile hast EDSS değeri ve yaş faktörü karşılaştırılmış ve anlamlı bir bağıntı bulunamamıştır fakat protein miktarları değişimi kendi içinde bağlantı arz etmektedir. CIS hasta grubu BOS sonuçlarında Pen-2xNumbl (r=0,47, p=0,0080) ve Notch1xNumbl (r=0,46, p=0,0094) pozitif korelasyon göstermiştir. RRMS BOS sonuçlarında ise NicatrinxNotch1(r=0,64, p=0,0001) arasında; PPMS BOS sonuçlarında ise NicastrinxPen-2 (r=0,47, p=0,0192) pozitif korelasyon bulunmuştur. ELISA bulgularımız grubumuzun önceki proteomik çalışma sonuçları ile uyum gösterirken, Notch sinyal yolağının MS’in ataklı ve ilerleyici formlarında aktif olduğunu ve bu yolakta yer alan proteinlerin biyobelirteç potansiyellerinin bulunduğunu göstermektedir. Ayrıca bu yolakta yer alan proteinlerin MS’in iki alt türüne özgü olarak protein hedefli tedavi potansiyelleri bulunduğunu da düşündürtmektedir.

Multiple sclerosis (MS) is an auto-inflammatory, immune-mediated and neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS) in which the myelin sheaths and axons are damaged. These damages disrupt the ability of the nervous system to communicate causing a wide variety of signs and symptoms. MS is a White and gray matter disease and in the majority of the cases has an onset late teens and early twenties. The cause of the MS is still argumentative but the evidence from recent studies focuses on the immune-mediated initiation and later progressing into neurodegenaration. Inflammatory elements (Th1, Th17, CD8+, B cells and macrophages) produced in the periphery enter the CNS through the damages of bloob-brain barrier (BBB) and these elements influence various processes such as activation of microglia, demyelination and axonal loss in the brain. The reasons of the BBB destruction and the details of the cellular infiltration into the CNS following this damage are still unclear. MS has a heterogeneous clinical presentation and course, starting from the radiologically isolated syndrome form (RIS) or the clinically isolated syndrome form (CIS). Clinical forms of MS include Relapsing–remitting MS (RRMS), primary progressive MS (PPMS), single-attack progressive MS (SAPMS), and secondary progressive MS (SPMS). Mainly, the diagnosis of MS is based on the clinical manifestations and examination in the presence of magnetic resonance imaging (MRI) findings. In clinic, the presence of the oligoclonal band(s) and elevated IgG index in cerebrospinal fluid (CSF) are also used as laboratory diagnostic criterias for diagnosis, however these are not specific to MS. Currently biological tests are still not sensitive and specific for neither diagnosis nor prognosis, which neccesitates urgent development of novel biomarkers for MS.This holds true for majorly progressive MS forms, in which patients do not exhibit relapses and remissions or show new MRI activity. Our group have previously conducted a proteome study in an MS cohort that have been collected from Istanbul University, Cerrahpaşa Faculty of Medical, Neurology Department between 2007-2015 having a total number of 221 patients and controls. The proteome study identified pathological pathways in MS patients CSF samples, including renin-angiotensin, aldestorene-regulated sodium reabsorption, complement-coagulation and Notch signalling pathways. The Notch1, Notch2, EP300, Psen1, Dtx1, Jag2, and Nicastrin proteins from the Notch signalling pathway were found more expressed in PPMS patients compared to other subtypes. Notch signalling is a conserved pathway during evolution in complex organisms and has crucial roles in the myelination/demyelination processes, regulation of cell-fate, maturation of tissue specific cells and controlling of homeostasis mostly in developmental stages. Due to the association of Notch pathway with myelination/demyelination processes, pathway proteins were thought as potential biomarkers for PPMS. Therefore, this study aimed to investige candidate biomarkers from Notch pathway proteins, namely Notch1, Numbl, Pen-2 and Nicastrin proteins in MS subtypes. Notch1, membrane bound receptor, and Nicastrin, a domain in gamma-secretase complex, were selected for evaluation of levels in patients and controls as confirmation the previous study. Pen-2, another sub-domain of the secretase complex, and NumbL, responsible of repression of the Notch receptors, were selected as new candidates. Study group is composed of CSF and serum samples of 30 RRMS, 30 CIS, 24 PPMS and 20 control patients who were diagnosed according to the revised McDonald’s criteria (2005-2010). The quantitative comparisons of these proteins were performed by ELISA and immunoblotting was also applied.  Notch1 serum levels shown significant differences among control and clinical subtypes (1,538.17 pg/μl in CIS, 1.543.67 pg/μl in RRMS, 1.852.24 pg/μl in PPMS, and 1,870.20 pg/μl in Control, p≤0.0001). The Nicastrin levels in serum and CSF did not show significant differences compared with control or among subtypes. There were significant differences observed for Numbl in CSF between control and CIS (1.999.25 pg/μl, 1.617.27 pg/μl, p≤0.01), control and RRMS (1.527.85 pg/μl, p≤0.001), CIS and PPMS (1.947.44 pg/μl, p≤0.01), RRMS and PPMS (p≤0.001). Numbl in serum also led to significant differences as seen in the following comparisons: control and CIS (1.899.56 pg/μl, 2.814.36 pg/μl, and p≤0.01), control and RRMS (7.082.86 pg/μl, p≤0.01), CIS and PPMS (1.804.48 pg/μl, p≤0.05), RRMS and PPMS (p≤0.05). Pen2 in CSF also presented significant changes between control and CIS (2.410.05 pg/μl, 1.821.05 pg/μl, p≤0.0001), control and RRMS (1.578.55 pg/μl, p≤0.0001); control and PPMS (2.065.72 pg/μl, p≤0.05); RRMS and PPMS (p≤0.001). Our findings are in compliance with results of our previous studies and indicate that notch pathway is active in remitting and progressive MS forms. It is suggested that, the notch pathway proteins have the potential to be used as biomarkers for RRMS and PPMS subtypes, which require replication in a bigger sample size and validation and in another MS cohort.
Investigation Of Notch Signalling Pathway Proteins As Potential Biomarkers For Differentiating Multiple Sclerosis Subtypes
Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2016
Keywords: multiple skleroz; biyobelirteçler; Notch Sinyal Yolağı; Proteomik; Western Blot Yöntemi; ELISA yöntemi; multiple sclerosis; biomarkers; Notch Pathway; Proteomics; Western Blotting; ELISA