1 STANBUL TEKNK ÜNVERSTES  FEN BLMLER ENSTTÜSÜ BAKTERYEL SELÜLOZ ÜRETMNDE FARKLI KARBON KAYNAKLARININ DEERLENDRLMES YÜKSEK LSANS TEZ Kimya Müh. Tuba KARAALP OCAK 2007 Anabilim Dalı : MÜHENDSLKLE LER TEKNOLOJLER Programı : MOLEKÜLER BYOLOJ – GENETK VE BYOTEKNOLOJ 2 STANBUL TEKNK ÜNVERSTES  FEN BLMLER ENSTTÜSÜ ALTERNATF BESN YAN ÜRÜNLERNDEN BAKTERYEL SELÜLOZ ÜRETM YÜKSEK LSANS TEZ Kimya Müh. Sezin YILMAZ (521041213) OCAK 2007 Tezin Enstitüye Verildii Tarih : 25 Aralık 2006 Tezin Savunulduu Tarih : 30 Ocak 2007 Tez Danımanı : Prof.Dr. Melek TÜTER Dier Jüri Üyeleri Prof.Dr. Seniha GÜNER Yrd.Doç.Dr. Nevin Gül KARAGÜLER 3 ÖNSÖZ Çalımalarım sırasında bilgi ve yardımlarını esirgemeyen Sn. Prof. Dr. Melek TÜTER’ e, yanımda olduunu her zaman hissettiim çalıma arkadaım Kimya Mühendisi Sezin YILMAZ’ a ve verdikleri destek ile her zaman yanımda olduklarını bildiim aileme teekkürü bir borç bilirim. ARALIK 2006 Tuba KARAALP 4 ÇNDEKLER KISALTMALAR vi TABLO LSTES vii EKL LSTES viii ÖZET ix SUMMARY x 1. GR VE AMAÇ 1 2. TEORK BÖLÜM 4 2.1. Bakteriyel Selüloz Biyosentezi 4 2.2. Bakteriyel Selüloz Fermantasyonu 8 2.3. Bakteriyel Selülozun Kullanım Alanları 12 2.4. Literatür Çalımaları 15 3. DENEYSEL ÇALIMALAR 21 3.1. Kullanılan Hammaddeler 21 3.1.1. Mikroorganizma 21 3.1.2. Melas 22 3.1.2.1 eker Kamıından Melas Eldesi 22 3.1.2.2 eker Pancarından Melas Eldesi 23 3.1.3. Besi Yeri 24 3.2. Fermantasyon 25 3.2.1. Fermantasyon Süresinin Belirlenmesi 26 3.2.2. Uygun Karbon Kaynaı Seçimi 27 3.2.3. Bakteriyel Selüloz Fermantasyonunda Melas Kullanımı 27 3.2.3.1 Melasta eker Tayini 27 3.1.3.2 Melasa Uygulanan Ön lemler 29 3.2.3.3 Farklı Konsantrasyonlarda Melas Çözeltilerinin Hazırlanması 30 5 4. SONUÇLAR VE TARTIMA 31 4.1. Fermantasyon Süresinin Belirlenmesi 31 4.2. Farklı Karbon Kaynaklarının Bakteriyel Selüloz Üretimine Etkisi 33 4.3. Farklı Balangıç Konsantrasyonlarına Sahip Melas Çözeltilerinin Bakteriyel Selüloz Verimine Etkisi 34 5. VARGILAR VE ÖNERLER 37 KAYNAKLAR 38 ÖZGEÇM 41 6 KISALTMALAR 1PFK : Fructose-1-phosphate kinase ATP : Adenosine triphosphate CS : Cellulose Synthase d : Younluk FBP : Fructose-1,6-biphosphate phosphatase FK : Fructokinase G6PDH : Glucose-6-phosphate dehydrogenase GK : Glikokinaz HPLC : High Pressure Liquid Chromatography HS : Hestrin Schramm m : Aırlık OD : Optical Density PGA : Phosphogluconic acid PGI : Phosphoglucoisomerase PGM : Phosphoglucomutase PTS : System of phosphotransferases rpm : Rotate per minute UDPGlc : Uridine diphosphoglucose UGP : Uridine diphosphoglucose pyrophosphorylase V : Hacim 7 TABLO LSTES Sayfa No Tablo 2.1 Selüloz Üreten Mikroorganizmalar…………. …………………… 4 Tablo 2.2 Besi Yeri Kompozisyonuna Göre Bakteriyel Selüloz Verimi……………………………………………………………... 19 Tablo 3.1 Melastaki Mineraller………….………………… ………………. 23 Tablo 3.2 Melastaki Vitaminler………….………………… ………………. 23 Tablo 4.1 Bakteriyel Selüloz Üretimine Karbon Kaynaının Etkisi………………………………………………………………. 33 8 EKL LSTES Sayfa No ekil 1.1 ekil 1.2 ekil 2.1 ekil 2.2 ekil 2.3 ekil 2.4 ekil 2.5 ekil 2.6 ekil 2.7 ekil 2.8 ekil 2.9 ekil 2.10 ekil 2.11 ekil 2.12 ekil 2.13 ekil 2.14 ekil 3.1 ekil 3.2 ekil 3.3 ekil 3.4 ekil 3.5 ekil 3.6 ekil 3.7 ekil 3.8 ekil 3.9 ekil 4.1 ekil 4.2 ekil 4.3 ekil 4.4 ekil 4.5 ekil 4.6 ekil 4.7 : Selülozun kimyasal yapısı............................................................ : Selüloz elde etme yöntemleri........................................................ : Bakteriyel selüloz oluumunun ematik gösterimi……………... : A. Xylinum’ da selüloz oluum mekanizması…………………… : A.xylinum’ da selüloz sentezinin biyokimyasal mekanizması….. : A.xylinum’ un karbon metabolizması…………………………… : Statik kültürde elde edilen bakteriyel selüloz…………………... : Karıtırmalı kültürde elde edilen bakteriyel selüloz……………. : Statik (A) ve karıtırmalı (B) koullarda el edilen bakteriyel selülozun SEM görüntüleri……………………………………… : Karıtırıcı tipleri (A) ve Maxblend karıtırıcılı reaktör (B)…….. : Mekanik karıtırıcılı (A) ve Hava kaldırmalı (B) reaktörlerde üretilen selülozun yapısı…………………………………………. : Bakteriyel selüloz ile kaplanmı yara…………………………… : Elektronik kaıt…………………………………………………. : Deiik balangıç glikoz konsantrasyonlarının selüloz verimine etkisi……………………………………………………………… : A.xylinum’ da deiik karbon ve azot kaynaklarının bakteriyel selüloz verimine etkisi……………………………………………. : Fermantörün ematik gösterimi………………………………….. : Liyofilize A.xylinum………………………………..……………. : Ampulün açılıı………………………………………………….. : eker kamıı…………………………………............................... : eker pancarı…………………………………………………….. : A.xylinum ile hazırlanan stoklar…………………………………. : Bakteriyel selüloz oluumu…………………………………….. : Saflatırma ileminden sonra elde edilen bakteriyel selüloz (A), kurutulmu bakteriyel selüloz (B)………………………………... : A.xylinum kolonileri……………………………………………… : Sakkarozun açık formülü………………………………………… : Bakteriyel selüloz veriminin zamana göre deiimi…………….. : Besi yerindeki glikoz miktarının zamana göre deiimi………… : Bakteriyel selüloz üretiminde zamana göre hücre büyümesi……. : Seçilen karbon kaynaına göre selüloz verimi…………………… : DSMZ 2004 no’ lu A.xylinum ile seçilen karbon kaynaına göre selüloz verimi…………………………………………………….. : Melaslı besi yerinde bakteriyel selüloz verimi…………………… : DSMZ 2004 no’ lu A.xylinum ile melaslı besi yerinde bakteriyel selüloz verimi…………………………………………………...... 1 2 5 6 7 8 9 9 10 11 12 13 14 17 18 20 21 21 22 23 24 25 26 26 27 31 32 32 33 34 35 35 9 BAKTERYEL SELÜLOZ ÜRETMNDE FARKLI KARBON KAYNAKLARININ DEERLENDRLMES ÖZET Selüloz, doada en çok bulunan polimerdir ve insanlar tarafından binlerce yıldır kullanılmaktadır. Alternatif selüloz üretim yöntemlerinin aratırılması ile ilgili çalımalar günümüzde de sürdürülmektedir. Bu çalımada, A.xylinum 2325 türü kullanılarak, bakteriyel selüloz üretiminde farklı karbon kaynaklarının deerlendirilmesi amaçlanmıtır. Çalımanın ilk bölümünde klasik Hestrin & Schramm besi yeri kullanılarak optimum fermantasyon süresi 10 gün olarak belirlenmitir. Daha sonra Hestrin & Schramm besi yerindeki glikoz, aynı oranlarda fruktoz, mannitol, sakkaroz ve laktoz ile deitirilerek, 10 gün süreyle statik koullarda fermantasyon gerçekletirilmitir. Bu çalımanın sonunda en yüksek bakteriyel selüloz verimini veren karbon kaynaı fruktoz olarak belirlenmitir. Karbon kaynaı olarak fruktoz kullanıldıında elde edilen bakteriyel selüloz verimi 3,7 g/L’ dir. Karbon kaynaı olarak mannitol kullanıldıında 2,9 g/L, sakkaroz kullanıldıında ise 2,0 g/L selüloz elde edilmitir. Laktoz kullanıldıında ise bakteriyel selüloz oluumu gözlenmemitir. Çalımanın son aamasında kompleks besi yeri olan melas ile bakteriyel selüloz sentezi gerçekletirilmitir. 20, 40, 60 ve 80 g/L balangıç eker konsantrasyonundaki melas çözeltileri ile 10 gün süreyle statik koullarda fermantasyon yapılmı, en yüksek verim balangıç eker konsantrasyonu 20 g/L olan melas çözeltisi ile 0,974 g/L olarak elde edilmitir. Balangıç eker konsantrasyonu arttıkça, selüloz veriminin dütüü gözlenmitir. 80 g/L balangıç eker konsantrasyonunda ise, bakteriyel selüloz oluumu gözlenmemitir. A.xylinum 2325 türünün kompleks besi yeri olan melası etkin bir ekilde kullanamadıı sonucuna varılmıtır. 10 EVALUATION OF DIFFERENT CARBON SOURCES ON BACTERIAL CELLULOSE PRODUCTION SUMMARY Cellulose is the most abundant polymer on the earth and used by people for thousands of years. Alternative ways for production of cellulose are still under investigation. In this paper, effect of different carbon sources on bacterial cellulose production are evaluated by using A.xylinum 2325. First of all, optimum time course for bacterial cellulose production was determined as 10 days. In defined Hestrin & Schramm medium different carbon sources are used instead of glucose. Among these carbon sources such as fructose, mannitol, sucrose and lactose, fructose gave the highest yield. The final concentration of bacterial cellulose in fructose containing medium under static conditions and 10 days of fermantation was measured as 3.7 g/L. When mannitol used as a carbon source 2,9 g/L cellulose was obtained. Also, sucrose gave only 2,0 g/L cellulose. In lactose containing medium no cellulose occured. In addition, bacterial cellulose production by A.xylinum using molasses medium was also carried out in static culture. 20, 40, 60 and 80 g/L initial sugar concentrations were evaluated. The maximum yield was obtained in 20 g/L initial sugar concentration. In molasses media containing 80 g/L initial sugar concentration, no bacterial cellulose production was observed. According to these results, molasses is not the efficient media for A.xylinum 2325. 11 1. GR VE AMAÇ Doada en çok bulunan polimer olan selüloz, insanlar tarafından binlerce yıldır kullanılmakta olup, alternatif üretim yöntemleri ile ilgili çalımalar günümüzde de halen sürdürülmektedir. ekil 1.1’de görülen selülozun yapısı oldukça basittir. Glikoz moleküllerinin -1,4-glukan balarıyla birlemesiyle oluur. Günümüzde selüloz doada en çok bitkilerden elde edilmektedir. Ancak bitkilerden elde edilen selüloz saf deildir. Lignin ve hemiselülozla birlikte bulunmaktadır. Bu ekilde saf selüloz elde edebilmek için saflatırma ilemi de yapmak gerekmektedir. Ayrıca günümüzde artan nüfus ve gelien teknoloji nedeniyle artan selüloz ihtiyacını karılayabilmek için daha çok alan tahrip edilmeye balanılmıtır. Bu durum direk olarak karbon döngüsünün deimesine neden olmakta ve global ısınma, radyasyon, ekolojik dengenin deimesi gibi kavramları ortaya çıkarmaktadır [1]. ekil 1.1 Selülozun kimyasal yapısı [2] Temel selüloz elde etme yöntemleri dört balık altında toplanabilir. Bu dört yöntem ekil 1.2’ de toplu halde gösterilmitir. Daha önce de bahsedildii gibi selülozun bitkilerden elde edilip, lignin ve hemiselülozdan saflatırılması en çok tercih edilen yöntemdir. Bir dier yöntem, selülozun mikroorganizmalardan biyosentez yoluyla elde edilmesidir. Literatür verilerine dayanarak kullanılan mikroorganizmalar alg (Vallonia), mantar (Saprolegnia, Dictystelium discoideum) ve bakteri (Acetobacter, Achromobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Sarcina, 12 Alcaligenes, Zoogloea) olarak sınıflandırılabilir. Seçilen mikroorganizma tipine göre elde edilen selülozun yapısı da farklılıklar göstermektedir. Ayrıca bu organizmaların hepsi ürettikleri selülozu hücre dıına veremediklerinden, saflatırma ilemi de gerektirmektedirler. Baka bir yöntemde ise, selobiyozil floridden balayarak saflatırılmı selülaz enzimi vasıtasıyla selüloz polimeri üretilmektedir. Bilinen en son yöntem ise, kemosentezle selüloz üretimidir. Bu yöntemde, glikozdan halka açma yöntemiyle polimerizasyonla selüloz üretilir [3]. ekil 1.2 Selüloz elde etme yöntemleri [3] Günümüzde mikroorganizmalardan fermantasyon ile polimer sentezi büyük önem taımaktadır. Gelien dünyanın ihtiyaçlarını karılayabilmek ve karbon döngüsünün devamlılıını salayabilmek için selüloz eldesinde birçok mikroorganizma ile çalımalar yapılmıtır. Ancak bu organizmaların çou ürettii selülozu hücre içinde tuttuundan fermantasyon maliyetleri yanında, mikrobiyal saflatırma ilemlerine de ihtiyaç duyulması yöntemin uygulanmasını zorlatırmaktadır. Selüloz sentezinde bir bakteri türü olan Acetobacter xylinum (A.xylinum) kullanıldıında ise, elde edilen selülozun hücre dıına verildii ve bu nedenle herhangi bir saflatırma ilemi gerektirmedii ve kimyasal yapısının bitkilerden elde edilen selülozla tamamen aynı olduu görülmütür. Mekanik özellikler kıyaslandıında ise, bitkilerden elde edilen selülozun lignin ve hemiselülozdan saflatırılması sırasında mekanik dayanımının azaldıı, bunun aksine A.xylinum’ dan elde edilen selülozun oldukça dayanıklı olduu görülmütür. 13 Bu çalımanın amacı, A.xylinum ile bakteriyel selüloz fermantasyonunda alternatif karbon kaynaklarının aratırılmasıdır. Bunun için optimum fermantasyon süresi belirlenerek, basit besi yerinde uygun karbon kaynaı seçimi ile ilgili çalımalar yürütülmü ve kompleks bir besi yeri olan melasın verime etkisi aratırılmıtır. 14 2. TEORK BÖLÜM 2.1 Bakteriyel Selüloz Biyosentezi Doada selüloz üreten mikroorganizmalar alg, mantar, bakteri olarak sınıflandırılabilir. Ancak seçilen mikroorganizma türüne göre, elde edilen selülozun yapısı da farklılıklar göstermektedir. Tablo 2.1’ de selüloz üretebilen mikroorganizmaların listesi verilmitir. Bu türlerden en çok tercih edileni Acetobacter türüdür. Tablo 2.1 Selüloz üreten mikroorganizmalar [4] TÜR SELÜLOZ YAPISI Acetobacter hücre dıı, eritlerden oluan tabaka Achromobacter lifli Aerobacter lifli Agrobacterium kısa lifler Alcaligenes lifli Pseudomonas belirgin olmayan lifler Rhizobium kısa lifler Sarcina ekilsiz Zooglea belirgin olmayan lifler A. xylinum, bilinen en etkili selüloz üreten mikroorganizmadır. Doada meyvelerde, meyve suyunda ve sirkede bulunur. Aerobik, gram-negatif, asetik asit bakterisidir. A.xylinum ile üretilen selüloz, bitkiler ve dier mikroorganizmalar ile elde edilen selülozlardan daha yüksek saflıktadır. Dier bir avantajı ise, selülozu ürettikten sonra hücre dıına saldıından herhangi bir saflatırma ilemi gerektirmemesidir. Tek bir A.xylinum hücresi saniyede 200.000 adet glikoz molekülünü -1,4-glukan balarıyla balayarak polimerize edebilir [5]. Bitkilerde bulunan selüloz dier polisakkaritlerle birlikte kompleks halinde hücre duvarının yapısını oluturmaktadır. A.xylinum’ da ise bunun tam tersine üretilen selüloz metabolik olarak inerttir ve saf olarak hücrenin dıına salınmaktadır [6]. 15 A.xylinum’ da bakteriyel selüloz biyosentezi kusursuz düzenlenmi, birkaç adımda gerçekleen birçok enzim, katalitik ve düzenleyici protein kompleksleri içeren spesifik bir prosestir. Proses, bakteriyel selüloz prekörsırı olan üridin difosfoglikoz (UDPGlc) sentezini takiben glikozun -1,4-glukan balarıyla polimerize olması ve oluan yüzlerce ve hatta binlerce selüloz polimerlerinin erite benzeyen karakteristik eklini almasından oluur. UDPGlc sentezi, prosesin glikoz polimerizasyonunun moleküler mekanizması ve hücre dıına ekstrüzyonu aamalarına göre daha bilinen bir reaksiyondur [4]. Selüloz sentezi, A.xylinum’ un dı membranı ve sitoplazmik mebranı arasında selüloz sentezleyen kompleks tarafından gerçekletirilir. Bu kompleks aynı zamanda bakteri üzerindeki porlarla da ilikilidir. ekil 2.1’ de bu kompleks ve selüloz üretimi görülmektedir [7]. ekil 2.1 Bakteriyel selüloz oluumunun ematik gösterimi [8] ekil 2.1’ de A ile gösterilen kısım, selüloz sentezleme bölümüdür. Tek bir bakteri hücresinde sayısız selüloz sentezleme bölümü bulunmaktadır. Her bir bölümde, 16 glukan zincirinden oluan lifler oluur. Daha sonra bu lifler birleerek erit haline gelirler. B ile gösterilen kısım ise, membran proteini olan selüloz sentaz (AcsAB protein) ve onunla ilikili proteinlerin (AcsC and AcsD) bulunduu kısımdır. Bu proteinlere, selüloz sentezleme kompleksi adı verilir ve dı membran ile sitoplazmik membran arasında bulunurlar [8]. 16 Elektron mikroskobuyla incelendiinde A.xylinum’ un yüzeyinde bulunan selüloz sentezleme bölümlerinin düz bir eksen üzerinde bulunduu gözlenmitir. Her bir pordan hücre dıına salınan 16 zincirli lif, parçalanamayan en küçük selülozik birim olduundan, selüloz ürünün balangıç bölümü olarak kabul edilir. Bu lifler, selülozun mikrofibril yapısı kalkoflor beyazı (Tinopal) ile boyandıında görülebilmektedirler ve yaklaık 1,5 nm uzunluundadırlar. ekil 2.2’ de de görülebilecei gibi selüloz yapısının oluumu rastgele gerçeklememektedir. Glukan balarının oluumundan itibaren, liflerin, mikrofibrillerin ve son olarak da erit eklindeki selüloz makromolekülünün oluumu hiyerarik bir düzen içinde gerçeklemektedir. Bu proses her ne kadar hücre dıında gerçeklese de, hücre tarafından yönetilmektedir. ekil 2.2 A. Xylinum’ da selüloz oluum mekanizması [6] Dier bir husus ise, A.xylinum’ da polimerizasyon ve kristalizasyon aamalarının birbirini tamamlayan önemli iki proses olmalarıdır. Kristalin mikrofibrillerin oluumu, ancak -1,4-glukan zincirleri halen oluuyor iken gerçekleebilmektedir. Polimerizasyon verimi, kristalizasyon prosesine balı olarak artı göstermektedir. Bu aamada, bakteriyel selüloz sentezinde sınırlayıcı adım, kristalizasyon prosesidir, denebilir [9]. Selüloz, A.xylinum’ un karbon metabolizmasının son ürünüdür. Pentoz fosfat döngüsü, krebs döngüsü ve glikoneogenez ile ilikilidir. Aerobik, asetik asit bakterisi olan A.xylinum’ da fosfofruktokinaz enzimi bulunmadıından glikoliz gerçeklememektedir. Selüloz sentezi, katabolik bir proses olan oksidasyon ile ilikilidir ve katabolik reaksiyonlarda üretilen enerjinin yaklaık %10’ unu tüketirken protein sentezi gibi anabolik reaksiyonları engellememektedir. A.xylinum, hegzoz, 17 gliserol, dihidroksi aseton, pirüvat ve dikarboksilik asit gibi çeitli karbon kaynaklarını yaklaık %50 verimle selüloza çevirebilir. Bu bileikler, krebs döngüsü, pentoz-fosfat döngüsü ve glikoneogenez sonucu biyosenteze dahil olurlar. Pentoz- fosfat döngüsü ile karbonhidratların oksidasyonu, krebs döngüsü ile organik asitlerin oksidasyonu gerçekleir [6]. Direkt selüloz sentezleyicisi olan UDPGlc, bitkiler de dahil olmak üzere birçok organizmada oldukça yaygın kullanılan bir yol ile üretilmektedir. Bu yolda; glikoz glikokinaz katalizörlüünde glikoz-6-fosfata, glikoz- 6-fosfat fosfoglikomutaz katalizörlüünde izomerizasyon ile glikoz-1-fosfata, glikoz- 1-fosfat UDPGlc fosforilaz enzimi ile UDPGlc’ a dönüür. Son aamada ise, selüloz sentaz enzimi ile, UDPGlc’ dan selüloz sentezlenir [4]. Bu mekanizma ekil 2.3’ te verilmektedir. ekil 2.3 A.xylinum’ da selüloz sentezinin biyokimyasal mekanizması [7] Bu dönüüm esnasında en önemli rol, UDP-Glikoz fosforilaz enzimindedir. Selüloz- negatif mutantlar (Cel-), bu enzim bulunmadıından, her ne kadar yüksek selüloz sentaz aktivitesi gösterseler de, selüloz sentezleyemezler. UDP-Glikoz fosforilaz aktivitesi kullanılan A.xylinum türüne balı olarak da deiiklik göstermektedir. Bilinen en yüksek aktivite BPR2001 türünde görülmektedir. UDP-Glikoz fosforilaz aktivitesindeki artı, selüloz veriminde de artı salamaktadır [4]. A.xylinum’ un bazı türleri ise karbon kaynaı olarak glikoz yerine fruktozu tercih ederler. Bu durumda izlenen yol; fruktozun fruktoz-1-fosfata, fruktoz-1-fosfatın fosfoglikoizomeraz enzimi katalizörlüünde glikoz-6-fosfata dönümesidir [6]. Glikoz-6-fosfat ise, ekil 2.3’ te verilen mekanizma ile selüloza dönütürülür. A.xylinum’ un karbon metabolizması ekil 2.4’ te ayrıntılı olarak verilmektedir. Glikoz Glikokinaz Glikoz-6- Fosfat Fosfoglikomutaz Glikoz-1- Fosfat UDP-Glikoz Fosforilaz UDP-Glikoz Selüloz Sentaz Selüloz 18 ekil 2.4 A.xylinum’ un karbon metabolizması [4] 2.2 Bakteriyel Selüloz Fermantasyonu Günümüze kadar, bakteriyel selüloz üretiminde deiik fermantasyon yöntemleri kullanılmıtır. Bu yöntemler; statik yöntem, karıtırmalı yöntem, karıtırmalı tank fermantörler ve hava kaldırmalı biyoreaktörler olarak sıralanabilir. stenilen ürünün özelliklerine göre seçilen fermantasyon tipi deiiklik göstermektedir. Statik yöntem; en yaygın ve en çok bilinen yöntemdir. A.xylinum aerobik bakteri olduundan fermantasyon hava-sıvı ara yüzeyinde gerçeklemektedir ve geni yüzey alanı gerektirmektedir. Bu nedenle oldukça maliyetli bir yöntemdir ve ticari açıdan kabul görmemektedir. Statik kültürde oluan selüloz kalın, deriye benzeyen beyaz bir tabaka halindedir. Hücre büyümesi ve fermantasyon sırasında bakteri hücreleri bu tabakaya tutunmu halde bulunurlar. Böylece selüloz hücrelerin asılı kalmasına ve oksijence zengin ortamda bulunmalarına yardımcı olur [10]. ekil 2.5’ te statik yöntemde elde edilen bakteriyel selüloz görülmektedir. 19 ekil 2.5 Statik kültürde elde edilen bakteriyel selüloz [4] Statik yöntemde fermantasyon 5-20 gün arasında devam eder. Selüloz tabakasının kalınlıı arttıkça oksijen difüzyonu zorlaacaından hücreler ölmeye balar. Statik yöntemin dier bir dezavantajı ise, ekim yapıldıktan sonra sisteme müdahale edilememesidir. Ortam pH’ ı ya da besi yeri kompozisyonu sürekli deimektedir, ancak bunları optimum seviyede uzun süre tutmak bu yöntemde mümkün olmamaktadır [11]. Karıtırmalı yöntemde; statik yöntem kadar yüksek verim elde edilememesine ramen, statik yönteme göre daha çok tercih edilmektedir. Bunun nedeni; maliyeti arttırmadan ölçek büyütmeye elverili bir yöntem olmasıdır. Karıtırmalı yöntemde elde edilen selüloz, statik yöntemin aksine, düzensiz, lifli küçük kürecikler eklindedir [4]. ekil 2.6’ da karıtırmalı yöntemde elde edilen selülozun yapısı görülmektedir. ekil 2.6 Karıtırmalı kültürde elde edilen bakteriyel selüloz [4] 20 Karıtırmalı yöntemde oksijen transferi daha iyi salanabilmektedir. Ancak selüloz verimi statik yönteme göre daha düüktür. Bunun nedeni ortamda selüloz üretemeyen mutantların (Cel-) olumasıdır. Cel- hücrelerin oluumu karıtırma ve havalandırmayla ilgilidir. Karıtırıcı tipi ve hızı seçimi bu nedenle oldukça önemlidir. Selüloz verimini arttırmak için dier bir yol ise, karıtırma ve havalandırma hızlarından etkilenmeyecek mutant A.xylinum türlerinin kullanılmasıdır [10]. ekil 2.5 ve ekil 2.6’ da da görülebilecei gibi statik ve karıtırmalı yöntemlerde üretilen selüloz ekil olarak oldukça farklıdır. Mikroskop altında mikrofibril yapıları incelendiinde yapılarındaki farklılık daha net gözlenebilmektedir. ekil 2.7’ de statik ve karıtırmalı kültürlerde elde edilen selülozun mikroskop altındaki mikrofibril yapıları verilmitir. ekilden görüldüü üzere, statik yöntemde elde edilen selüloz aynı eksende yer alan liflerden oluurken, karıtırmalı yöntemde düzgün olmayan, kıvrılmı ve yer yer üst üste binmi selüloz lifleri elde edilir. Ayrıca, karıtırmalı yöntemde elde edilen selüloz mikrofibrilleri statik yöntemdekilere göre daha incedir. Sürekli karıtırma esnasında oluan kuvvetler nedeniyle selüloz yapısında deiiklikler görülmektedir [12]. (A) (B) ekil 2.7 Statik (A) ve karıtırmalı (B) koullarda el edilen bakteriyel selülozun SEM görüntüleri [12] Karıtırmalı tank fermantörlerde en sık karılaılan problem, zamanla selüloz olutukça ortam viskozitesinin artmasıdır. Bu durumda karıtırmayla ilgili güçlükler ortaya çıkmakta ve oksijen transferi zorlamaktadır [13]. Bu nedenle reaktör tasarımında karıtırma miktarı ve oksijen transfer kapasitesi iki önemli parametre olmaktadır [14]. 21 Yapılan çalımalar sonucunda, ortam viskozitesini düürebilmek için, karıtırıcının reaktördeki sıvıyla arasındaki mesafenin mimimum olması gerektii gözlemlenmitir. Bakteriyel selüloz üretiminde en uygun karıtırıcı tipinin Maxblend karıtırıcı olduu belirtilmitir. ekil 2.8’ de karıtırmalı tank fermantörlerde kullanılan karıtırıcı tipleri ve Maxblend tipi karıtırıcıyla dizayn edilmi reaktör örnei görülmektedir [15]. (A) (B) ekil 2.8 Karıtırıcı tipleri (A) ve Maxblend karıtırıcılı reaktör (B) [14-15] Karıtırıcılı reaktörlerde, oksijen transferini arttırmak için öncelikle karıtırıcı hızını arttırmak düünülmütür. Ancak, büyük ölçekte düünüldüünde istenilen hıza ulaabilmek için gerekli motor gücü, proses maliyetini oldukça arttırmaktadır. Bunun yerine oksijen transferini arttırmak için, oksijence zenginletirilmi hava kullanmak veya yüksek basınç altında çalımak daha uygundur. Yüksek basıncın, mikroorganizmalar üzerinde inhibitör etkisi gösterdii ve aminoasit gibi maddelerin oluumuna yol açtıı bilinmektedir, ancak bakteriyel selüloz üretimiyle ilgili böyle bir olumsuz etki gözlenmemitir [15]. Yapılan çalımalar sonucu, mekanik karıtırıcıların olumsuz etkisini ortadan kaldırabilmek için, bakteriyel selüloz üretiminde hava kaldırmalı reaktörlerin kullanımına balanılmıtır. Hava kaldırmalı reaktörlerde, oksijence zenginletirilmi hava kullanıldıından oksijen transferi istenildii gibi salanmakta ve karıtırıcı olmadıından daha az enerji ile çalıılabilmektedir. Chao ve arkadaları, yaptıkları çalımada aynı A.xylinum türünü kullanarak, mekanik karıtırıcılı reaktörlerde kullanılan enerjinin 1/5’i kadar enerji ile, hava kaldırmalı reaktörde %20 daha yüksek verimde selüloz elde etmilerdir [16]. 22 Hava kaldırmalı reaktörlerde oluan selülozun yapısı da karıtırıcılı reaktörlere göre farklılık göstermektedir. Hava kaldırmalı reaktörlerde selüloz, kürecikler eklinde oluurken, mekanik karıtırıcılı reaktörlerde lifli yapıdadır. ekil 2.9’ da bu fark görülmektedir [17]. (A) (B) ekil 2.9 Mekanik karıtırıcılı (A) ve Hava kaldırmalı (B) reaktörlerde üretilen selülozun yapısı [17] Günümüze kadar yapılan çalımalarda, endüstriyel ölçekte bakteriyel selüloz fermantasyonunda en kolay uygulanabilen, en düük maliyetli ve en yüksek verimin elde edildii fermantasyon tipi, hava kaldırmalı reaktörlerdir [17]. 2.3 Bakteriyel Selülozun Kullanım Alanları Bakteriyel selüloz, yüksek saflıkta olması ve mekanik-kimyasal dayanım özelliklerinin oldukça iyi olması nedeniyle çok çeitli kullanım alanına sahiptir. üphesiz ki, bakteriyel selülozun en önemli kullanım alanı kaıt üretimidir. Ancak üretim maliyetlerinin düürülememi olması nedeniyle, yüksek mekanik dayanım, yüksek yırtılma direnci gibi özelliklere sahip özel kaıt üretimlerinde kullanılabilmektedir. Dier bir önemli konu ise, toksik gazların absorbsiyonunda kullanılan aktif karbonun yapısında %30 normal kaıt hamuru yerine %5 bakteriyel selüloz kullanıldıında aynı miktarda absorbsiyon yapılabilmesidir. Sony Corp. firması tarafından üretilen hoparlör ve kulaklıklarda da bakteriyel selüloz kullanılmaktadır. Böylelikle daha yüksek ve temiz tonlarda ses elde edilebilmektedir [18]. 23 Bakteriyel selülozun ümit vadettii dier bir alan ise tıp sektörüdür. Yaraları sarmada kullanıldıında, yüksek sıvı tutma kapasitesi sayesinde selülozun içindeki su istenilen medikal solüsyon ile deitirilerek kullanılmaktadır. Ayrıca yanıklarda acıyı azaltma, enfeksiyon kapmayı önleme, kolay iyilemeyi salama, tedavi süresini ve maliyetini azaltma gibi oldukça önemli faydaları olduundan geçici deri olarak kullanılmaktadır [19]. ekil 2.10’ da bakteriyel selüloz ile kaplanmı bir yara görülmektedir. Ayrıca bakteriyel selüloz, yapay kan ve lenf damarlarının ve idrar yollarının yapısında da kullanılmaktadır [20]. Sıvı haldeyken yüksek mekanik dayanıma sahip olması, biyolojik olarak uyumlu olması ve insan ve hayvan vücudunda sindirilememesi gibi avantajlarından dolayı medikal alanda oldukça ümit vermektedir. ekil 2.10 Bakteriyel selüloz ile kaplanmı yara [19] Aratırmacılar bakteriyel selülozun fiziksel ayırma ileminde membran olarak kullanılması konusunda da çalımalar yürütmektedir. Amperometrik glikoz sensörlerinde, bakteriden elde edilen selüloz kullanıldıında, aaçtan elde edilen selüloza göre 6-7 kat daha uzun süre stabiliteyi koruyabildii açıklanmıtır. Bakteriyel selülozla kaplanmı sensörler seyreltilmi kan içerisinde 200 saate kadar dayanım gösterirken, seyreltilmemi kanda 24 saat dayanabilmektedirler. Bu çalımanın sonucunda, klasik amperometrik glikoz sensörlerin ömrününün bakteriyel selüloz ile kaplanarak oldukça arttırılabilecei açıklanmıtır. Ayrıca bakteriyel selüloz, suda çözünebilen karboksimetil selüloz (CMC), polietilen glikol (PEG) gibi dier polimerler ile de kompozit malzemeler oluturarak, membran yapısının ve por büyüklüklerinin ayarlanmasına olanak salamaktadır. 24 Bakteriyel selüloz için gelecek vadeden dier bir konu ise, elektronik kaıt üretimidir. Brown ve Shah, bakteriyel selüloz katmanının içine elektronik boyayı gömmülerdir. Daha sonra bu katmanı effaf elektrodların arasına yerletirmilerdir. Balangıçta sistem düz beyaz bir kaıt gibi görülmektedir, ancak elektrodlara elektrik akımı verildiinde boyanın rengi koyulmaya balamı ve elektrik akımı kesildikten sonra da rengini korumutur. Düük enerji tüketimi bu sistemin önemli avantajlarından biridir. Sisteme daha sonra ters akım uygulandıında, boyanın renginin açıldıını ve bataki düz beyaz kaıt görünümünü tekrar aldıı belirtilmitir. Bakteriyel selülozla üretilen elektronik kaıdın dier bir avantajı da, görüntünün normal kaıtla elde edilen görüntüyle aynı olmasıdır [21]. ekil 2.11’ de elektronik kaıdın bir görüntüsü verilmitir. ekil 2.11 Elektronik kaıt [21] Bakteriyel selüloz gıda sektörüne de hizmet verebilmektedir. Düük kalorili içeceklerde, pastane ürünlerinde, dondurma üretiminde kullanılmaktadır. Düük kalorili çikolatalı içeceklerde kıvam arttırıcı olarak %3 xantan reçinesi kullanılmaktadır. Bunun yerine aynı miktarda bakteriyel selüloz ilave edildiinde aynı viskozite elde edilebilmektedir. Ancak, ürüne ısıl ilem uygulandıında xantan reçinesi kullanılan içecekte viskozite düerken, bakteriyel selüloz kullanılan içecek kıvamını korumaktadır. Dier bir ilginç aratırma ise, dondurma üretiminde yapılmıtır. Dondurmaya bakteriyel selüloz ilave edildiinde, dondurma erise bile selülozun yüzey geriliminden ötürü akmamaktadır. Bakteriyel selülozun gıda sektöründe kullanımı ürünün kalitesini oldukça arttırmaktadır. 25 Biyoreaktör dizaynlarında yapılacak iyiletirmeler, düük maliyetli hammadde kullanımı gibi iyiletirmeler ile verimin ve üretim ölçeinin arttırılması ile bakteriyel selüloz gelecekte endüstriyel kullanım için oldukça cazip bir hale gelebilecektir. 2.4 Literatür Çalımaları Bu bölümde, A.xylinum kullanılarak bakteriyel selüloz üretimiyle ilgili literatürde yapılan çalımalardan örnekler verilecektir. Hong-Joo Son ve arkadaları, elmadan izole ettikleri A. Xylinum türü olan A9’ un statik yöntem yanında çalkalamalı yöntemde de yüksek verimle selüloz üretebildiini göstermi ve fermantasyon koullarını optimize etmilerdir. Bu çalımaya kadar, selüloz üretiminde statik yöntem kullanılmıtı. Bunun nedeni çalkalamalı fermantasyon prosesi esnasında Cel- mutantların oluması ve verimin oldukça dümesiydi. Ancak endüstriyel ölçekte düünüldüünde statik yöntem ile selüloz üretimi için çok geni yüzey alanına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu durum, prosesin verimliliini oldukça düürmektedir. Hong-Joo Son ve arkadaları, izole ettikleri A9 türü ile hem statik, hem de çalkalamalı fermantasyon prosesinde aynı ölçüde yüksek verim elde edebilmilerdir. Yaptıkları çalımalarda, bu türün 200 dev/dk’ da bile selüloz üretme yeteneini kaybetmediini yüzey gerilimine karı dayanıklı olduunu gözlemlemilerdir. Çalımalarına, aırlıkça %2 glikoz, %0.5 polipepton, %0.675 Na2HPO4.12H2O, ve %0.115 sitrik asit monohidrat içeren distile su ile hazırlanmı besi yeri kullanarak balamı ve bu besi yeri üzerinde modifikasyonlar yapılmıtır. Çalımalarında ayrıca sıcaklık etkisini incelemilerdir. 20 ile 40 0C arasındaki sıcaklıklarda fermantasyon gerçekletirilmitir. 25-30 0C arasında en yüksek verimin elde edildiini ve 35 0C’ nin üstünde selüloz üretiminin azaldıını görmülerdir. pH 3.0-9.0 arasında çalıarak pH etkisini gözlemlemiler ve pH 6.5’ te maksimum verime ulaıldıını görmülerdir. Literatürde pH 4.5-7.5 arası optimum çalıma pH’ ı olarak kabul edilmektedir. Fermantasyon koulları belirlendikten sonra karbon kaynaklarının etkisini incelemilerdir. En yüksek verim, karbon kaynaı olarak glikozun kullanıldıı besi yeri ile elde edilmitir. Çalımada daha sonra farklı azot kaynaklarının etkisi incelenmitir. En yüksek verim azot kaynaı olarak maya ekstratı kullanıldıında elde edilmitir. Ancak maya ekstraktı endüstriyel ölçekte ekonomik olmadıından mısır urubunun kullanılabileceini belirtmilerdir. Daha sonra ortamdaki fosfat miktarının selüloz verimine etkisi incelenmitir. Aırlıkça 26 %0-1.0 oranlarında besi yerine Na2HPO4.12H2O ekleyerek selüloz verimine bakılmıtır. En yüksek verimin %0.8 Na2HPO4.12H2O eklendiinde elde edildiini görmülerdir. Bu oranın altında ya da üstünde selüloz veriminde düü gözlenmitir. Sitrik asidin ise selüloz verimine etkisinin olmadıı görülmütür, bu nedenle daha sonraki çalımalarını sitrik asitsiz besi yeri hazırlayarak sürdürmülerdir. Son olarak fermantasyon verimine etanol ve organik asitlerin etkisini incelemilerdir. %4 glikoz içeren besi yerine %0.2 oranında etanol, asedik asit, fumalik asit, laktik asit, malik asit, pirüvik asit, sükisinik asit ilave ederek selüloz verimini ölçmülerdir. En yüksek selüloz verimi ortamda etanol varken elde edilmektedir. Ortama %1.4 oranında etanol ilave edildiinde etanolsüz besi yerine oranla verimin 4 kat arttıını gözlemlemilerdir. Etanol, Cel+ bakterilerin Cel-’ e dönümesini engelledii için verimi oldukça arttırmaktadır. Bu sonuçlara göre çalımalarının sonunda A9 türü için optimum besi yerini, pH 6.5’da %4 glikoz, %0.1 maya ekstraktı, %0.7 polipepton, %0.8 Na2HPO4.12H2O ve %1.4 etanol olarak belirlemilerdir [22]. Krystynowicz ve arkadaları, çalımalarında A. Xylinum E25 türünü kullanarak optimum fermantasyon koullarını salamaya çalımılardır. Yaptıkları çalımalar sonucunda kullandıkları türün statik koullarda çok daha stabil olduunu ve yüksek verimle selüloz ürettiini, buna karılık karıtırmalı fermantasyon sırasında Cel- mutantların olutuunu ve bu mutantların oluumunun kullanılan medya kompozisyonuna balı olduunu gözlemlemilerdir. Aratırıcılar çalımalarında karıtırmalı ve havalandırmalı kültürlerde selüloz üretmeyen mutantların oluumunun oldukça arttıını ve selüloz veriminin dütüünü belirtmilerdir. Bunun nedeni, statik koullarda selüloz üreten hücrelerin oksijence zengin olan besi yeri- hava ara yüzeyine doru hareket edip burada selüloz membranı oluturarak oksijenin alt kısımlara inmesini sınırlandırması, karıtırmalı koullarda ise, eit havalandırma salandıından hücrelerin selüloz üretmek yerine çoalmayı tercih etmesi eklinde açıklamılardır. Bu sonuca göre deiik besi yeri kompozisyonlarının statik ve karıtırmalı kültürlerde Cel- mutantların oluumuna etkisi incelenmitir. Statik koullarda deiik besi yeri kompozisyonlarının ve etanolün mutant oluumuna etkisinin olmadıını, ancak karıtırmalı kültürlerde %80’ e kadar mutant oluumu gerçekletiini gözlemlemilerdir. Aratırmacılar, HS besi yerinde bir takım modifikasyonlar yaparak optimum besi yerini belirlemilerdir. Buna göre, standart besi yerine %1 etanol ve %0.05 MgSO4.7H2O eklemilerdir. Ortamda etanol 27 bulunması hücre konsantrasyonu ve üretim hızını arttırmıtır. Bunun nedeni, etanolün sistemde ilave enerji kaynaı olarak kullanılarak ATP oluumunu arttırması ve böylece glikozun sadece selüloz üretiminde kullanılması eklinde açıklanmıtır. Çalıma, farklı balangıç glikoz konsantrasyonlarıyla sürdürülmü ve düük glikoz konsantrasyonlarının verimi arttırdıı tespit edilmitir. ekil 2.12’ den de görülebilecei gibi, en yüksek selüloz verimi ve en kalın selüloz membranı glikoz konsantrasyonu 20 g/L iken elde edilse de, kuru aırlıktaki en yüksek selüloz miktarı glikoz konsantrasyonu 5g/L iken elde edilebilmitir. Bu durumun bakteriyel selüloz üretim maliyetlerinin azaltılmasında büyük ölçüde önemli olacaı çalımada ayrıca belirtilmitir [23]. ekil 2.12 Deiik balangıç glikoz konsantrasyonlarının selüloz verimine etkisi [23] Ramana K.V. ve arkadaları, Hindistan Ulusal Koleksiyonundan temin ettikleri A.xylinum türü ile bakteriyel selüloz üretiminde, deiik karbon ve azot kaynaklarının etkisini incelemilerdir. Karbon kaynaı olarak, sorbitol, glikoz, galaktoz, laktoz, asetik asit, mannitol, maltoz, niasta ve sakkaroz kullanmılardır. Hazırladıkları besi yeri kompozisyonu; 50g/L karbon kaynaı, 5 g/L amonyum sülfat, 5 g/L maya ekstraktı, 0,05 g/L MgSO4.7H2O eklindedir. Kullandıkları her karbon kaynaına karılık, besi yerindeki amonyum sülfat yerine deiik azot kaynakları kullanmılardır. Bunlar, kazein hidrolizatı, glisin, soya fasulyesi, pepton ve sodyum glutamattır. Çalımalar sonunda, optimum azot kaynaının karbon kaynaı seçimiyle oldukça ilikili olduunu görmülerdir. Karbon kaynaı sakkaroz veya mannitol olarak seçildiinde mikroorganizma azot kaynaı olarak kazein hidrolizatı veya peptonu tercih etmektedir. Dier karbon kaynakları, sorbitol, 28 galaktoz, maltoz, niasta ve asetik asit, oldukça düük verimle selüloz üretebilmektedir. Bu karbon kaynakları kullanıldıında elde edilen selüloz verimi 0.4-2.0 g/L arasında deimektedir. Azot kaynakları kıyaslandıında ise, karbon kaynaı olarak glikoz, mannitol, sukroz kullanıldıında en iyi verimin pepton, kazein hidrolizatı ve amonyum sülfat ile elde edildiini gözlemlemilerdir. Bu sonuçlar ekil 2.13’ de verilmektedir. ekil 2.13 A.xylinum’ da deiik karbon ve azot kaynaklarının bakteriyel selüloz verimine etkisi. Karbon kaynakları: (A) sakkaroz, (B) glikoz, (C) mannitol, azot kaynakları: (1) amonyum sülfat, (2) pepton, (3) sodyum glutamat, (4) kazein hidrolizat, (5) glisin, (6) soya fasulyesi [24] Aratırmacılar, A.xylinum ile bakteriyel selüloz üretiminde uygun karbon kaynaklarının glikoz, mannitol ve sakkaroz, azot kaynaklarının ise, kazein hidrolizat, pepton, glutamat ve amonyum sülfat olduunu belirtmilerdir. Bu çalımayla düük maliyetle selüloz elde etmenin besi yeri optimizasyonu ile salanabileceini göstermilerdir [24]. Sherif Keshk ve arkadaları, melaslı besi yerinin etkisini A.xylinum ATCC 10245 türünü kullanarak incelemilerdir. Çalımalarında glikoz ve eker pancarından elde edilen melaslı besi yerini paralel incelemi ve karbon kaynaının verime etkisini gözlemlemilerdir. Çalımalarına balarken, A.Xylinum ATCC 10245’ i klasik HS besi yerinde canlandırmılardır. Daha sonra bu kültürden 0.5 ml alarak klasik HS veya modifiye edilmi besi yerinin 15 mL’ sine ekim yapmılardır. 28 0C’ de, pH 6’ da statik koullarda, 5-7 gün fermantasyon gerçekletirmiler ve elde edilen selülozu saflatırmılardır. Çalımaları sonucunda elde edilen selüloz verimleri Tablo 2.2’ de verilmektedir. Tartılan selüloz miktarları 250 mL sıvı besi baz alınarak 29 hesaplanmıtır. Tablodan da görülebilecei gibi besi yerindeki glikoz konsantrasyonu azaltılıp melas konsantrasyonu arttırıldıkça selüloz veriminde de artı gözlenmektedir. Çalımada, bakteriyel selüloz üretiminde kompleks besi yeri olan melasta, glikozlu besi yerine göre daha yüksek verim elde edildiini ve elde edilen selülozun fiziksel yapısında herhangi bir deiiklik gözlenmedii belirtilmitir. Ayrıca, yüksek olan üretim maliyetlerini düürmede melaslı besi yeri kullanımının oldukça avantajlı olacaı da vurgulanmıtır [25]. Tablo 2.2 Besi yeri kompozisyonuna göre bakteriyel selüloz verimi [25] Glikoz (g) Melas (g) Selüloz (g) 2.0 0.0 1.34 1.8 0.2 1.40 1.4 0.6 1.44 1.0 1.0 1.50 0.6 1.4 1.56 0.2 1.8 1.60 0.0 2.0 1.75 Sangok B. ve Makota S., yaptıkları çalımada melas kullanarak kesikli fermentasyon ile bakteriyal selüloz üretme çalımaları yapmılardır. Yaygın yöntemler kullanılarak selüloz üretimi kültivasyon süresinin uzun olması ve glikoz, fruktoz, sukroz gibi karbon kaynaklarının pahalı olması nedeniyle ekonomik olmamaktadır. Bu nedenle daha etkin üretim metodlarının gelitirilmesi ve daha ucuz karbon kaynaklarının bulunması çok büyük önem taımaktadır. eker üretiminin en önemli yan ürünü olan melas, günümüzde en ucuz karbon kaynaı olması nedeniyle mikrobiyal çalımalarda büyük önem taımaktadır. Laktik asit, polihidroksibütirat (PHB), etanol, pullulan ve xantan gibi önemli ürünlerin fermantasyonunda melas kullanılmaktadır. Sangok B. ve çalıma arkadaları A.xylinum BPR2001 ve melas kullanılarak bakteriyel selüloz üretmilerdir. Melas, fermantörde kullanılmadan içindeki safsızlıklardan ve aır metallerden arındırılmıtır. Bunun için sıcaklık-H2SO4 saflatırma yöntemi uygulanmıtır. ekil 2.14’ te fermantasyon proseslerinde kullanılan fermantör görülmektedir. 30 ekil 2.14 Fermantörün ematik gösterimi. (1)hava kompresörü, (2)akı ölçer, (3)hava filtresi, (4)numune alma bölümü, (5)pH elektrodu, (6)DO probu, (7)sıcaklık elektodu, (8)inokülasyon ve besleme nozülü, (9)ısıtıcı, (10)havalandırma bölümü, (11)4 N NaOH, (12)4 N H2SO4, (13)besi yeri, (14)besi yeri pompası, (15)gaz çıkıı, (16)O2-CO2 gaz ölçer, (17)kontrol paneli, (18)kaydedici [26] Aratırmacılar, A.xylinum BPR2001’ in karbon kaynaı olarak fruktoz kullanıldıında yüksek verimde selüloz üretebildiini görmülerdir. Yüksek melas konsantrasyonlarında hücre çoalması yavaladıından selüloz verimi dümü, buna karılık düük melas konsantrasyonlarında (20g/L), fruktoz ile aynı miktarda selüloz üretilebildii görülmütür. Çalımada, kesikli fermantasyonda, düük eker konsantrasyonlarında melaslı besi yeri kullanımının oldukça avantajlı olduu ve Melasın maliyetinin fruktozun 1/250’si olduu düünüldüünde, bakteriyel selüloz üretiminde melasın oldukça önemli bir karbon kaynaı olacaı sonucuna varılmıtır [26]. 31 3. DENEYSEL ÇALIMALAR 3.1 Kullanılan Hammaddeler 3.1.1 Mikroorganizma Bu çalımada, Alman kültür koleksiyonu DSMZ’ den alınan 2325 numaralı A.xylinum kullanılmıtır. Mikroorganizma ekil 3.1’ de gösterildii gibi liyofilize olarak temin edilmi ve laboratuarda canlandırılmıtır. ekil 3.1 Liyofilize A.xylinum [27] Ampul ekil 3.2’ de gösterildii gibi açılmı ve mikroorganizma canlandırılmıtır. Steril ortamda ampul balıı alevde ısıtılmı, daha sonra cımbızla kırılmıtır, içteki ampul çıkarılmıtır. Daha sonra ampulde bulunan steril pamuk yine cımbız yardımıyla çıkarılarak liyofilize mikroorganizma peleti önceden hazırlanmı ve steril edilmi besi yerine ekilmitir. ekil 3.2 Ampulün açılıı [27] 32 3.1.2 Melas Melas, eker pancarı veya eker kamıından eker üretme prosesinde bir yan ürün olarak açıa çıkmaktadır. Melasın kalitesi, eker pancarı veya kamıının olgunluuna, ekstrakte edilen eker miktarına ve ekstrüksiyon yöntemine balı olarak deiim gösterebilmektedir. Çalımada kullanılan ve eker pancarından elde edilen melas, Ankara-Türkiye eker fabrikaları A.’ den temin edilmi olup, birinci kalite melastır. 3.1.2.1 eker Kamıından Melas Eldesi eker kamıı ezilerek yapraklarından ayrılır ve ezilerek suyu ekstrakte edilir. Daha sonra bu sıvı kısım kaynatılarak, suyu uçurulur ve kristalize eker elde edilir. eker ayrıldıında elde edilen kısım birinci melastır. Bu ilemle ekerin tamamı kristalize edilemediinden, melastaki eker konsantrasyonu oldukça yüksektir. Bu ekilde kaynatma ilemi üç kez tekrarlanır. Üçüncü kaynatmanın sonunda elde edilen melas oldukça koyu renklidir ve rafine edilmi eker olan sakkaroza göre vitamin ve minarelce oldukça zengindir. Ayrıca kalsiyum, magnezyum ve demir de içermektedir. Bir yemek kaıı melas günlük mineral ihtiyacının %20’ sini karılamaktadır [28]. ekil 3.4’ te eker kamıı görülmektedir. ekil 3.3 eker Kamıı [29] 33 3.1.2.2 eker Pancarından Melas Eldesi eker pancarından elde edilen melas eker kamıından elde edilene göre farklıdır. Ara kademelerde elde edilmez, son kristalizasyon prosesinden sonra elde edilir. Yaklaık %50 oranında eker içerir. Bu eker büyük oranda sakkarozdur, ancak glikoz ve fruktoz da içermektedir. Hayvan yeminde katkı olarak kullanılmaktadır [29]. ekil 3.5’ te eker pancarı görülmektedir. ekil 3.4 eker Pancarı [30] eker kamıı ve eker pancarından elde edilen melasın mineral içerii açısından karılatırılması Tablo 3.1’ de verilmitir. Tablo 3.1 Melastaki Mineraller [28] Mineral eker kamıı eker pancarı Bakır (mg/kg) 36 13 Demir (mg/kg) 249 117 Manganez (mg/kg) 35 10 Çinko (mg/kg) 13 40 Melastaki vitaminler ise Tablo 3.2’ de kıyaslanmaktadır. Tablo 3.2 Melastaki Vitaminler [28] Vitamin eker kamıı eker Pancarı Biotin (mg/kg) 0.36 0.46 Kolin (mg/kg) 745 716 Pantotenik Asit (mg/kg) 21.0 7.0 Riboflavin (mg/kg) 1.8 1.4 Tiamin (mg/kg) 0.9 - 34 Tablo 3.1 ve 3.2’ den de görülebilecei gibi eker kamıından elde edilen melas vitamin ve minarelce eker pancarından elde edilen melasa göre oldukça zengindir. Bu özelliinden dolayı eker kamıından elde edilen melas besin kaynaı olarak ticari bir deere sahipken, eker pancarından elde edilen melasın böyle bir kullanımı yoktur. Bu nedenle fermantasyon prosesinde deerlendirilmesi, alternatif bir kullanım alanı yaratmanın yanında, proses maliyetlerini de düürmeye yardımcı olabilecektir. 3.1.3 Besi yeri Besi yeri hazırlanırken kullanılan tüm kimyasallar Merck ve Reidel-de Haen firmalarından temin edilmitir. Mikroorganizma canlandırılırken Hestrin & Schramm (HS) besi yeri kullanılmıtır. Besi yeri kompozisyonu, aırlık/hacimce %2 glikoz, %0.5 pepton, %0.5 maya ekstraktı, %0.27 Na2PO4, %0.15 sitrik asit monohidrattan olumaktadır. Distile su ile hazırlanan besi yeri 1 N asetik asit ile pH 5.0’ e ayarlanmıtır. Daha sonra 121 0C’ de 30 dk otoklavlanmıtır. Soutulan besi yerinin 50 mL’ si 250 mL’ lik erlene alınmı ve liyofilize haldeki mikroorganizma ilave edilerek 30 0C’ de 7 gün bekletilmitir. 7. günün sonunda erlende selüloz oluumu gözlenmitir. Daha sonra bu kültürden stok hazırlanmıtır. Stok hazırlarken öncelikle distile su ile %60’ lık gliserol çözeltisi hazırlanmı ve otoklavlanmıtır. Daha sonra steril ortamda ependorf tüplere 100 µL kültür, 1000 µL gliserol çözeltisi ilave edilmi, hazırlanan stoklar -80 0C’ de saklamaya alınmıtır. Daha sonraki çalımalarda bu stoklar kullanılmıtır. Hazırlanan stoklar ekil 3.3’ te gösterilmektedir. ekil 3.5 A.xylinum ile hazırlanan stoklar 35 3.2 Fermantasyon Stok hazırlandıktan sonra ölçek büyütülmütür. Ölçek büyütülürken; ilk olarak 50 ml’ lik erlene 1/5 oranını salamak için 10 ml sıvı besi yeri koyulmu, üzerine stok ilave edilmi ve 30 0C’de 150 rpm’ de 2 gün bekletilmitir. Daha sonra 100 ml’ lik erlene 18 ml saf besi yeri 2 ml önceki kültürden koyularak aynı koullarda yine 2 gün karıtırıcıda bırakılmıtır. Daha sonra 250 ml’ lik erlene 45 ml saf besi yeri 5 ml 100’lük erlendeki kültürden ilave edilerek fermantasyon sonuna kadar statik büyümeye bırakılmıtır. Erlende selüloz oluumu ekil 3.6’ da görülmektedir. ekil 3.6 Bakteriyel Selüloz Oluumu Fermantasyon sonrası elde edilen bakteriyel selüloz saflatırılmıtır. Saflatırma ilemi gerçekletirilirken elde edilen selüloza, canlı hücrelerden tamamen arındırmak için 4200 rpm’ de 15 dk santrifüj ilemi uygulanmı ve süzülmü, böylece selüloz sıvı kısımdan ayrılmıtır. Daha sonra selüloz 0,1 N NaOH çözeltisinde 80 0C’ de 20 dk bekletilmi ve asetik asit ile yıkanarak nötralletirilmitir. Son olarak distile su ile yıkanarak 85 0C’ de aırlıı sabitlenene kadar 4 saat kurutulmu ve tartım alınarak kaydedilmitir. Elde edilen bakteriyel selülozun kurutma ileminden önceki ve sonraki halleri ekil 3.7’ de görülmektedir. Bakteriyel selüloz, yüksek su tutma kapasitesinden dolayı kurutma ileminden sonra oldukça incelmektedir. 36 (A) (B) ekil 3.7 Saflatırma ileminden sonra elde edilen bakteriyel selüloz (A), kurutulmu bakteriyel selüloz (B) Çalımalar süresince kirlenme olup olmadıı belli aralıklarla gözlemlenmitir. Bunun için, sıvı Hestrin & Schramm besi yerine %1.5 agar ilave edilerek, petrilere dökülmü, kuruması beklenmi ve 50 L kültür ekilmitir. Cam özeyle yayılmı ve sıcak odada (30 0C) bir hafta bekletilmitir. Koloni oluumu gözlendikten sonra, oluan bu koloniler mikroskop altında literatürdekilerle kıyaslanmıtır. Kirlilik oluumu gözlemlenmemitir. Elde edilen koloniler ekil 3.8’ de görülmektedir. ekil 3.8 A.xylinum kolonileri 3.2.1 Fermantasyon Süresinin Belirlenmesi Fermantasyon süresinin belirlenmesi için, alınan stok, içinde10 mL HS besi yeri olan 50 mL’ lik erlene ekilmi, statik koullarda 30 0C’ de 3 gün bekletilmitir. Daha sonra içinde 18 mL taze besi yeri olan erlene önceki kültürden 2 mL ilave edilerek yine aynı koullarda 3 gün bekletilmi ve bu süre sonunda deney balatılmıtır. Deney süresince kontrollü 4 set ile çalıılmıtır. 250 mL’ lik erlenlere 45 mL saf HS besi yeri, 5 mL önceki kültürden ekim yapılmıtır. Statik koullarda 30 0C’ de 37 fermantasyon gerçekletirilmitir. 3., 7., 10. ve 14. günlerde oluan selüloz saflatırılıp tartım alınmı, HPLC (Shimadzu) cihazı ile ortamdaki glikoz konsantrasyonu belirlenmi, spektrofotometre (Shimadzu) ile 600 nm’ de optik younluk (OD) ölçülmütür. Sonuçlar göz önüne alınarak optimum fermantasyon süresi belirlenmitir. Bundan sonraki çalımalarda bu süre kullanılmıtır. 3.2.2 Uygun Karbon Kaynaı Seçimi Çalımanın bu bölümünün amacı, HS besi yerinde karbon kaynaını deitirerek en yüksek verimde selüloz üreten karbon kaynaını tespit etmektir. Bunun için, glikoz yerine maltoz, fruktoz ve sakkaroz aırlık/hacimce %2 oranında olacak ekilde besi yerine ilave edilmitir. Fermantasyon süresi sonunda elde edilen selüloz saflatırılıp tartılarak uygun karbon kaynaı seçilmitir. 3.2.3 Bakteriyel Selüloz Fermantasyonunda Melas Kullanımı Çalımanın bu bölümünün amacı, kompleks besi yeri olan melasın bakteriyel selüloz sentezinde alternatif besin kaynaı olarak kullanılabilirliini aratırmaktır. Bunun için öncelikle melasta eker tayini yapılmı, daha sonra safsızlık ve aır metallerden arındırmak için ısıl-H2SO4 ilemleri yapılmı ve farklı eker konsantrasyonlarında melas çözeltileri hazırlanmıtır. 3.2.3.1 Melasta eker Tayini Melas, sakkaroz ve indirgen ekerler içermektedir. Sakkaroz bir disakkarittir ve hidrolize edildiinde 2 monosakkarite dönümektedir, bunlar glikoz ve fruktozdur. Sakarozun kimyasal yapısı ekil 3.9’da görülmektedir. ekil 3.9 Sakkarozun açık formülü [31] Melastaki eker miktarını tayin etmek için titrasyon, gravimetrik ve kolorimetrik yöntemler kullanılmaktadır. Bu çalımada, bir titrasyon yöntemi olan Lane-Eynon 38 metodu kullanılmıtır. Metodun temeli, bürette bulunan eker çözeltisinin, erlende bulunan kaynayan bakır sülfat çözeltisi ve indikatör olan metilen mavisiyle titre edilerek, fruktoz, glikoz gibi indirgen ekerlerin bakır sülfatla reaksiyona girmesini salamaktır. Ortamdaki bakır sülfat tükendikten sonra eklenen ilk eker damlası rengi maviden beyaza döndürecektir. Eklenen eker miktarı kaydedilerek, indirgen eker miktarı hesaplanır. Ancak bu yöntemin en büyük dezavantajı, indirgen ekerlerin türünün hesaplanamamasıdır [32]. Çalımaya balarken, 5 gr melas tartılmı, saf su ile 250 mL’ ye seyreltilerek %2’ lik eker çözeltisi elde edilmitir. Daha sonra bu eker çözeltisinden 25 mL örnek alınarak tekrar saf su ile 100 mL’ ye seyreltilmi %0.5’ lik eker çözeltisi elde edilmi ve bu elde edilen çözelti bürete alınmıtır. Erlene ise, 12.5 mL Fehling A ve 12.5 mL Fehling B çözeltisi alınıp, üzerine büretteki çözeltiden 10 mL ilave edilerek ısıtılmaya balanmıtır. Fehling A çözeltisi hazırlanırken, 69.28 gr CuSO4.5H2O 1 lt. distile suda çözülür, Fehling B çözeltisi hazırlanırken ise, 346 gr ‘Rochelle’ tuzu (KNaC4H4O6.4H2O) ve 120 gr NaOH 1 L distile suyla tamamlanır. Erlendeki çözelti kaynamaya baladıında 3-4 damla metilen mavisi ilave edilerek, titrasyon balatılmıtır. Mavi renkte bir deiim gözlenmediinden, kullanılan melasta indirgen eker bulunmadıı tespit edilmitir. Bu çalımanın kontrolünü yapabilmek için, aynı ilemler %2’ lik çözelti ile de tekrarlanmıtır. Erlene 12.5 mL Fehling A ve 12.5 mL Fehling B çözeltileri koyulmu, üzerine büretteki %2’ lik eker çözeltisinden 10 mL ilave edilerek ısıtılmaya balanmıtır, kaynama balayınca da metilen mavisi eklenerek titrasyon yapılmıtır. Çalıma sonunda daha deriik bir çözelti ile çalıılmasına ramen renk deiimi gözlenemediinden, melasın içinde indirgen eker bulunmadıı kesinletirilmitir. Bu çalımadan sonra sakkaroz miktarının tayini için inversiyon yapılmıtır. Erlene 25 ml %2’ lik eker çözeltisi koyulup, üzerine 1 N HCl çözeltisinden 15 mL ilave edilmi ve kaynatılmıtır. Daha sonra çözelti soutulmu ve bazik hale getirebilmek için renk pembeye dönene kadar %10’ luk NaOH ilave edilmi, hazırlanan bu çözelti bürete alınmıtır. Erlene ise, 12.5 mL Fehling A ve 12.5 mL Fehling B çözeltileri koyulmu ve ısıtılmaya balanmıtır. Kaynama balayınca 3-4 damla 39 metilen mavisi eklenerek mavi renk kaybolup, effaflaıp, alt tabakada çökelti oluana kadar titrasyon yapılmıtır. Renk döndüünde, büretteki çözelti sarfiyatı 41.6 mL olarak kaydedilmitir. Standart tablodan bu miktara karılık gelen invert eker deeri 124.85 olarak okunmutur. Buradan toplam eker miktarı hesaplanmıtır. Toplam eker miktarı = (invert eker deeri *100) / çözelti sarfiyatı (3.1) eitlii ile hesaplanır. Buna göre, Toplam eker miktarı = (124.85*100) / 41.6 = 0.3 mg’ dır. Melastaki toplam eker konsantrasyonu = (0.3 / 0.5) * 100 (3.2) = % 60 Melastaki gerçek eker konsantrasyonu, hesaplanan toplam eker konsantrasyonunun %95’ i olarak kabul edilmektedir. Bu durumda; Gerçek eker konsantrasyonu = 60*0.95 = %57 olarak hesaplanır. Çalımada kullanılan melas indirgen eker içermediinden, bu %57’ lik ekerin tamamı sakkarozdan olumaktadır. 3.2.3.2 Melasa Uygulanan Ön lemler Melas, fermantasyon prosesinde kullanılmadan önce içindeki safsızlıklardan arındırmak için ön ileme tabi tutuldu. Öncelikle 50 g melas tartıldı ve distile su ile 250 ml’ ye tamamlandı. Çözelti homojen olana kadar karıtırıldı ve katı partiküllerin ayrılması için 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edildi. Daha sonra çöken kısım süzülerek ayrılmı, kalan sıvı kısım ise, öncelikle ısı daha sonra ısı-H2SO4 muamelesi ile fermantasyonda kullanılacak hale getirilmitir. Isıl ilemde, çözelti 120 0C’ de 20 dk ısıtılmı ve daha sonra oda sıcaklıında bir gece bekletilmitir. Ertesi gün çözelti 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edilmi ve süzülmütür. Daha sonra 4 N H2SO4 ile pH 3.0’ e ayarlandı ve oda sıcaklıında bir gece bekletilmitir. Ertesi gün 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edilmi ve süzülerek sıvı kısım ayrılmıtır. Bu sıvı kısım, 120 0C’ de 20 dk ısıtılmı ve oda sıcaklıında bir gece bekletilmitir. Ertesi gün tekrar 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edilmi ve süzülerek safsızlıklardan arındırılmıtır. Fermantasyon süresince bu saflatırılan melas çözeltisi kullanılmıtır. 40 3.2.3.3 Farklı Konsantrasyonlarda Melas Çözeltilerinin Hazırlanması Deney süresince 4 farklı konsantrasyonda melas çözeltisi hazırlanarak fermantasyon gerçekletirildi ve konsantrasyonun selüloz verimine etkisi incelendi. Bu nedenle çalımaya balamadan önce melastaki eker konsantrasyonu belirlendi. Melas ön ileme tabii tutulurken, 50 g melas alınıp, 250 ml’ ye tamamlanmıtı. Bu durumda melas konsantrasyonu; d = m/V (3.3) eitliinden d = (50g*0,57)/0,25L = 114 g/L olarak hesaplanır. Ön ilem sırasında 12,5 mL 4N H2SO4 ile muamele yapıldıından balangıçtaki eker konsantrasyonu deimitir. Bu deiim; d = (d1V1 + d2V2)/ (V1 + V2) (3.4) eitlii ile hesaplanır. d = (114*0,25 + 0*0,0125)/ (0,25 + 0,0125) d = 108,6 g/L olarak belirlenir. eker konsantrasyonu 108,6 g/L olarak belirlenen bu çözeltiden, 50’ er mL’ lik sırasıyla 20 g/L, 40 g/L, 60 g/L ve 80 g/L olmak üzere 4 farklı çözelti hazırlandı. Bu konsantrasyonları elde edebilmek için; 20 g/L = (108,6* V1) + (0*VSU) / 50 (3.5) eitliinden yararlanıldı. Bu durumda; 20 g/L’ lik melas çözeltisi hazırlayabilmek için 9.2 mL melas alınıp distile suyla 50 mL’ ye tamamlanmıtır. Aynı ekilde, 40 g/L’ lik çözelti için 18.4 mL melas, 60 g/L’ lik çözelti için 27.6 mL, 80 g/L’ lik çözelti için 36.8 mL melas alınarak 50 mL’ ye tamamlanmıtır. Daha sonra 250 mL’ lik erlenlere bu çözeltilerden 1/5 oranını salayabilmek için 45 mL melas çözeltisi, 5 mL A.xylinum kültürü koyularak 10 gün süreyle fermantasyon gerçekletirilmitir. Fermantasyon sonunda elde edilen selüloz saflatırılarak, tartım alınmıtır. 41 4. SONUÇLAR VE TARTIMA 4.1 Fermantasyon Süresinin Belirlenmesi Deneysel çalımanın ilk bölümünde HS besi yeri kullanılarak statik koullarda 30 0C’ de çalıılmı ve optimum fermantasyon süresi hesaplanmıtır. Bunun için 14 gün süreyle fermantasyon gerçekletirilmi ve 3, 7, 10 ve 14. günlerde numune alınarak, selüloz oluumu, hücre büyümesi ve glikoz tüketimi hesaplanmıtır. Deney süresince bakteriyel selüloz oluumu ekil 4.1’ de verilmektedir. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 ZAMAN(GÜN) SE LÜ LO Z VE R M  (G /L ) ekil 4.1 Bakteriyel Selüloz Veriminin Zamana Göre Deiimi ekil 4.1’ de de görülebilecei gibi selüloz üretimi zamanla artmaktadır. 10. günün sonunda üretilen selüloz miktarı 3,2 g/L iken, 14. günün sonundaki miktar 3,5 g/L’ dir. Fermantasyon süresince bakteriyel selüloz oluurken, besi yerinde bulunan glikozun tüketim hızı HPLC ile ölçülmütür. ekil 4.2’de glikoz tüketim erisi görülmektedir. 42 0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 0 3 6 9 12 15 ZAMAN (GÜN) TÜ K ET L EN G L K O Z M K TA R I (g/ L) ekil 4.2 Besi Yerindeki Glikoz Miktarının Zamana Göre Deiimi ekil 4.2’ den de görülebilecei gibi selüloz miktarı 3. günün sonunda 7,9 g/L iken, 10. günün sonunda ölçülemeyecek kadar azalmıtır. Ortamdaki canlı hücre miktarı ise, 600 nm’ de spektrofotometre ile ölçülmütür. Sonuçlar ekil 4.3’ te verilmektedir. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 ZAMAN (GÜN) O D (60 0 n m ) ekil 4.3 Bakteriyel Selüloz Üretiminde Zamana Göre Hücre Büyümesi Yapılan çalımalar sırasında, 10. günden itibaren ortamda glikoz konsantrasyonu ve canlı hücre miktarı büyük ölçüde azalmaktadır. Bunun yanında 10. günden itibaren bakteriyel selüloz üretim hızı da dümektedir. Bu veriler göz önüne alınarak, bakteriyel selüloz üretiminde optimum fermantasyon süresi 10 gün olarak belirlenmi ve dier çalımalarda bu süre göz önüne alınmıtır. 43 4.2 Farklı Karbon Kaynaklarının Bakteriyel Selüloz Üretimine Etkisi Çalımanın bu bölümünde farklı karbon kaynakları kullanılarak selüloz verimi hesaplanmıtır. Kullanılan karbon kaynakları ve elde edilen selüloz miktarları Tablo 4.1’ de verilmektedir. Fermantasyonlar 30 0C’ de, statik koullarda, 10 gün süre ile gerçekletirilmitir. Tablo 4.1 Bakteriyel selüloz üretimine karbon kaynaının etkisi Karbon kaynaı Bakteriyel selüloz verimi (g/L) Glikoz 3,3 Laktoz 0 Mannitol 2,9 Sakkaroz 2 Fruktoz 3,7 Tablo 4.1’ de de verildii gibi en yüksek verimde selüloz, karbon kaynaı olarak fruktoz kullanıldıında elde edilebilmektedir, onu glikoz izlemektedir. Sıralamalı sonuçlar ekil 4.4’ te verilmitir. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 FRUKTOZ GLKOZ MANNTOL SAKKAROZ LAKTOZ KARBON KAYNAI B A K TE R Y EL SE LÜ LO Z VE R M (G /L ) ekil 4.4 Seçilen karbon kaynaına göre selüloz verimi 44 Aynı koullarda DSMZ’ den alınan DSM 2004 no’ lu A.xylinum kültürü ile çalııldıında elde edilen bakteriyel selüloz verimi ise, ekil 4.5’ te verilmektedir. ekil 4.5 DSMZ 2004 no’ lu A.xylinum ile seçilen karbon kaynaına göre selüloz verimi ekil 4.4 ve 4.5 incelendiinde kullanılan mikroorganizmaya göre farklı karbon kaynaklarının daha etkin bir ekilde kullanılabilecei görülmektedir. A.xylinum 2325 ile en yüksek verim, karbon kaynaı fruktoz olduunda elde edilirken, A.xylinum 2004 kullanıldıında en yüksek verim, karbon kaynaı sakkaroz olduunda elde edilebilmektedir. 4.3 Farklı Balangıç Konsantrasyonlarına Sahip Melas Çözeltilerinin Bakteriyel Selüloz Verimine Etkisi Çalıma süresince 4 farklı melas konsantrasyonunda çalıılarak, 10 gün süreyle statik koullarda, 30 0C’ de fermantasyon gerçekletirilmitir. Çalımanın sonunda elde edilen selüloz miktarları ekil 4.6’ da verilmektedir. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Glikoz Sukroz Fruktoz Mannitol Laktoz KARBON KAYNAI B ak te riy el Se lü lo z Ve rim i (g /L ) 45 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 20 40 60 80 MELASTAK EKER KONSANTRASYONU (%) SE LÜ LO Z VE R M  (G /L ) ekil 4.6 Melaslı Besi Yerinde Bakteriyel Selüloz Verimi ekil 4.6’ da da görülebilecei üzere melastaki eker konsantrasyonu arttıkça elde edilen selüloz miktarı azalmaktadır. Melastaki eker konsantrasyonu % 20 iken 0,974 g/L selüloz üretilmi, eker konsantrasyonu %40’ a çıkarıldıında 0,718 g/L’ ye dümü, %60’ ta ise, 0,224 g/L selüloz üretilebilmitir. eker konsantrasyonu %80’ e çıkartıldıında selüloz oluumu gözlenememitir. Bunun nedeni, ortamdaki fazla eker konsantrasyonun mikroorganizma üzerinde inhibitör etkisi yapması eklinde açıklanabilir. ekil 4.7’ de ise, aynı koullarda A.xylinum DSM 2004 kullanıldıında elde edilen bakteriyel selüloz verimi görülmektedir. ekil 4.7 DSMZ 2004 no’ lu A.xylinum ile melaslı Besi Yerinde Bakteriyel Selüloz Verimi ekil 4.6 ve 4.7 incelendiinde, farklı A.xylinum türleri ile çalııldıında aynı koullarda melaslı besi yerinde, farklı verimler elde edildii gözlemlenmitir. 20 g/L eker konsantrasyonu ile çalııldıında DSM 2004 no’ lu A.xylinum ile 1,132 g/L selüloz elde edilirken, DSM 2325 no’ lu A.xylinum kullanıldıında 0,974 g/L selüloz 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 20 40 60 80 eker konsantrasyonu(g/L) Se lu lo z v er im i (g /L ) 46 elde edilebilmitir. eker konsantrasyonu 40 ve 60 g/L’ ye çıktıında, 2004 no’ lu A.xylinum ile elde edilen selüloz verimi çok büyük deiim göstermezken, 2325 no’ lu A.xylinum ile elde edilen verim hızla dümektedir. Tüm çalımaların aynı koullarda (30 0C, pH 5.0, 10 gün süreyle statik fermantasyon) gerçekletii düünülürse aradaki fark, 2004 no’ lu A.xylinum türünün, melası 2325 no’ lu A.xylinum türüne göre daha iyi kullanabildii eklinde açıklanabilir. Kullanılan melasın %100 sakkarozdan olutuu düünüldüünde, 2004 no’ lu A.xylinum türünün karbon kaynaı olarak sakkarozu, 2325 no’ lu A.xylinum’ a göre daha iyi kullanması beklenmektedir. Bu durum, Bölüm 4.3’ te verilen basit besi yerinde karbon kaynaı seçimi ile ilgili yapılan çalımanın sonuçlarında, sakkaroz kullanıldıında 2004 no’ lu A.xylinum’ la 3,4 g/L selüloz, 2325 no’ lu A.xylinum’ la ise, 2 g/L selüloz elde edilmesi ile de dorulanmaktadır. Seçilen mikroorganizma türüne göre, aynı besi yeri ve aynı fermantasyon koullarında çalıılsa bile, elde edilen bakteriyel selüloz verimi farklılık gösterebilmektedir. Bu durumda yüksek verimle bakteriyel selüloz üretebilmek için, fermantasyon koullarının iyiletirilmesi ya da yüksek verimde selüloz üretme kabiliyetine sahip mutant A.xylinum türlerinin kullanılması ile ilgili çalımaların yapılması gerekmektedir. 47 5. VARGILAR VE ÖNERLER Yapılan deneysel çalımada A.xylinum 2325 türü kullanılarak besi yeri optimizasyonu ile bakteriyel selüloz verimi arttırılmaya çalıılmıtır. Tanımlı besi yerinde karbon kaynaı ile yapılan çalımada en yüksek verim, fruktoz kullanıldıında elde edilmitir. Fruktoz, oldukça pahalı bir karbon kaynaı olduundan, denemeler daha farklı karbon kaynakları ve ya asitleri ile sürdürülebilir. Deneysel çalımalar statik fermantasyon yöntemi ile gerçekletirilmitir. Literatürdeki çalımalarda hava kaldırmalı biyoreaktörler ile yüksek verimde bakteriyel selüloz veriminin mümkün olduu görülmütür. A.xylinum 2325 türü ile hava kaldırmalı biyoreaktörlerde fermantasyon gerçekletirilebilir. Çalımanın son bölümünde kompleks besi yeri olan melas kullanılarak, bakteriyel selüloz verimi incelenmitir. Sonuçlar kıyaslandıında A.xylinum 2325 türü için, melaslı besi yerinde bakteriyel selüloz veriminin, tanımlı besi yerinde elde edilen verime göre daha düük olduu gözlenmitir. Bu durum, melasa yapılan ön ilem sırasında aır metallerden yeterince arındırılmadıından kaynaklanabilir. Melasın saflatırılmasında, potasyum ferrosiyanit ilemi ve sülfürik asit - aktif karbon ilemleri gibi alternatif saflatırma yöntemleri denenebilir. Elde edilen bakteriyel selülozun, fiziksel özellikleri ve mekanik dayanımı aratırılarak, membran üretiminde kullanımı üzerine çalımalar yürütülebilir. 48 KAYNAKLAR [1] Brown, Jr., R.M., 2006, Microbial Cellulose: A New Resource for Wood, Paper, Textiles, Food and Specialty Products www.botany.utexas.edu/facstaff/facpages/mbrown/position1.htm [2] http://hal.lamar.edu/~sessumga/polysaccharides.html, 2006. [3] Klemm, D., Schumann, D., Udhardt, U. and Marsch, S., 2001. Bacterial Synthesized Cellulose- Artificial Blood Vessels for Microsurgery, Progress in Polymer Science, 26, 1561-1603. [4] Bielecki1, S., Krystynowicz, A., Turkiewicz, M. and Kalinowska, H., Bacterial Cellulose, 40-46. [5] Hestrin, S. and Schramm, M., 1954. Synthesis of cellulose by Acetobacter Xylinum, Biochem J., 58, 345-352. [6] Ross, P., Mayer, R. and Benziman, M., 1991. Cellulose Biosynthesis and Function in Bacteria, Microbiological Reviews, 55, 35-38. [7] Jonas, R. and Farah, L.F., 1998. Production and Application of Microbial Cellulose, Polymer Degredation and Stability, 59, 101-106. [8] Saxena1, I.M., Dandekar, T. and Brown, Jr., R.M., 2005. Mechanisms in Cellulose Biosynthesis, Oxford Journals, 96, 9-21. [9] Benziman, M., Haigler, C.H. and Brown, Jr., R.M., 1980. Cellulose biogenesis: Polymerization and crystallization are coupled processes in Acetobacter xylinum, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77, 6678-6682. [10] Vandamme, E.J., Baets, D.S., Vanbaelen, A., Joris, K. and Wulf, D.P., 1998. Improved Production Of Bacterial Cellulose and Its Application Potential, Polymer Degradation and Stability, 59, 93-99. [11] Final Thesis, 2005. http://www.rpi.edu/~weberd/Final%20Thesis.doc [12] Czaja, W., Romanovicz, D. and Brown, R.M., 2004. Structural Investigations of Microbial Cellulose produced in Stationary and Agitated Culture, Cellulose, 11, 403-411. 49 [13] Kouda, T., Naritomi, T., Yano, H. and Yoshinaga, F., 1998. Inhibitory Effect of Carbon Dioxide on Bacterial Cellulose Production by Acetobacter in Agitated Culture, Journal of Fermantation and Bioengineering, 85, 1998. [14] Kouda, T., Yano, H. and Yoshinaga, F., 1997. Effect of Agitator Configuration on Bacterial Cellulose Productivity in Aerated and Agitated Culture, Journal of Fermentation and Bioengineering, 83, 371-376. [15] Kouda, T., Naritomi, T., Yano, H. And Yoshinaga, F., 1997. Effects of Oxygen and Carbon Dioxide Pressures on Bacterial Cellulose Production by Acetobacter in Aerated and Agitated Culture, Journal of Fermantation and Bioengineering, 84, 124-127. [16] Chao, Y., Ishida, T., Sugano, Y. and Shoda, M., 2000. Bacterial Cellulose Production by Acetobacter xylinum in a 50-L Internal-Loop Airlift Reactor, Biotechnoloy and Bioengineering, 68, 345-351. [17] Cheng, P.H., Wang, P.M., Chen, J.W. and Wu, W.T., 2002. Cultivation of Acetobacter xylinum for the Bacterial Cellulose Production in a Modified Airlift Reactor, Biotechnology and Applied Biochemistry, 35, 125-132. [18] Geyer, U., Heinze, T., Stei, A., Klenn, D., Marsch, S., Schumann, D. and Schmauder, H., 1994. Formation, derivatization and applications of bacterial cellulose, Int. J. Biol. Macromol, 16, 343-347. [19] Czaja, W., Krystynowicz, A., Bielecki, S. and Brown, M.R., 2006. Microbial Cellulose- The Natural Power to Heal Wounds, Biomaterials, 27, 145- 151. [20] Backdahl, H., Helenius, H. and Bodin, A., 2006. Mechanical properties of bacterial cellulose and interactions with smooth muscle cells, Biomaterials, 27, 2141-2149. [21] Shah, J. and Brown, M.R., 2005. Towards Electronic Paper displays made from Microbial Cellulose, Applied Microbial Biotechnology, 66, 352- 355. [22] Son, H.J., Heo, M.S., Kim, Y.G. and Lee, S.J., 2001. Optimization of Fermentation Conditions for the Production of Bacterial Cellulose by a Newly Isolated Acetobacter sp. A9 in Shaking Conditions, Biotechnology and Applied Biochemistry, 33, 1-5. 50 [23] Krystnowicz, A., Czaja, W., Jezierka, A.W., Miskiewicz, M.G., Turkiewicz, M. and Bielecki, S., 2002. Factors Affecting the Yield and Properties of Bacterial Cellulose, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 29, 189-185. [24] Ramana, K.V., Tomar, A. and Singh, L., 2000. Effect of Various Carbon and Nitrogen Sources on Cellulose Synthesis by Acetobacter xylinum, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 16, 245-248. [25] Keskh, S., Razek, T. and Sameshima, K., 2006. Bacterial Cellulose Production From Beet Molasses, African Journal of Biotechnology, 5, 1519-1523. [26] Bae, S. and Shoda, M., 2004. Bacterial Cellulose Production by Fed-Batch Fermentation in Molasses Medium, Biotechnol. Prog., 20, 1366-1371. [27] German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, 2004. http://www.dsmz.de/microorganisms/main.php?content_id=5 [28] Curtin, L.V., 1983. Molasses – General Considerations, National Feed Ingredients Association, West Des Moines, Iowa. [29] http://en.wikipedia.org/wiki/Molasses, 2006. [30] http://farmstats.defra.gov.uk/cs/farmstats_data/schools/1_crops.asp, 2006. [31] http://en.wikipedia.org/wiki/Sucrose, 2006. [32] http://www-unix.oit.umass.edu/~mcclemen/581Carbohydrates.html, 2006 51 ÖZGEÇM Tuba KARAALP, 17.01.1983 tarihinde stanbul’ da dodu. 1999 yılında Özel Dou Fen Lisesinden mezun oldu. 2004 yılında .T.Ü Kimya Mühendisliini bitirdi. Aynı yıl, Moleküler Biyoloji, Genetik ve Biyoteknoloji yüksek lisans programına baladı.