Altına Özgül Bağlanan Peptit İçeren Alkalin Fosfataz Enzimi İle Kalsiyum Fosfat Biyomineralizasyonunun Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Abstract

Anorganik yüzeylere özgül olarak bağlanan genetik yöntemlerle tasarlanmış peptitler, doğadan esinlenen çok işlevli sistemlerin oluşturulması için bir önemli üstünlükler sağlamaktadır. Kısa amino asit zincirlerinden oluşan bu peptitler moleküler bağlayıcılar olarak geleneksel yöntemlerin karşılaştığı güçlüklere çözüm olarak kullanılabilecek işlevsel biyomoleküllerdir. Bu çalışmada beş sıralı tekrar biçiminde altına özgü bağlanan peptitin alkalin fosfataz enzimine moleküler biyoloji yöntemleriyle eklenmiş yapısı, kalsiyum fosfat mineralizasyonunun gerçek zamanlı takip edilmesi amacıyla kullanılmıştır. Kalsiyum fosfat kemik ve diş gibi sert dokuların ana maddesi olan önemli bir biyomineral olarak hem omurgalı hem de omurgasız canlılarda farklı kristal yapılarda bulunmaktadır. Kuramsal açıdan olduğu kadar tedavi alanında pratik bakımından da önemli olmasından dolayı kalsiyum fosfatın hem oluşum hem de kristal faz geçişleri hakkında birçok çalışma yürütülmektedir. Alkalin fosfataz enzimi fosfat grubu içeren kimyasal yapılarndan hidroliz tepkimesi ile anorganik fosfat grubu açığa çıkmasını sağlama özelliğine sahiptir. Bu nedenle mineral oluşumu çalışmalarında biyominerallerin üretilmesi için söz konusu enzimin bu tür tepkimelerinden esinlenilmektedir. Yüzey plazmonik rezonans spektroskopisi moleküler etkileşimlerin gerçek zamanlı incelenmesini sağlayan çok hassas bir karakterizasyon yöntemidir. Ayrıca SPR proteinlerin katı yüzeylerle özellikle altın yüzeyle etkileşimini incelemek açısında yararlı bir tekniktir. Bu çalışmada GEPI molekülleriyle güçlendirilmiş altına özgü bağlanma özelliği olan alkalin fosfataz enzimi SPR yöntemi kullanılarak mineral oluşumunun gerçek zamanlı incelenmesi amaçlanmıştır. Bu deneysel çalışmalarda izlenen yöntemler hem biyomineral oluşumunun gerçek zamanlı takibine olanak sağlamış hem de genetik yöntemlerle tasarlanan çok işlevli alkalin fosfataz enziminin altına özgü bağlanma özellikleri incelenme imkânı sunmuştur. Ayrıca doğal enzime kıyasla GEPI molekülleriyle işlevselleştirilmiş alkalin fosfatazın daha yüksek aktivite gösterdiği bulunmuştur. Elde edilen sonuçlara göre GEPI bağlı alkalin fosfataz altın yüzey üzerinde biyomineral oluşumunu tetikleme özelliğine ek olarak kalsiyum fosfat oluşumunun yüzey plazmonik rezonans yöntemi ile takibine olanak sağlamıştır. Yüzey plazmonik resonans spektroskopisinin biyomineral oluşumu hakkında uzun süredir tartışmalı bir konu olan kalsiyum fosfatın olası kristal faz geçişlerini destekleyen veriler sağladığı düşünülmektedir.

Genetically engineered peptides for inorganics (GEPIs) that have the ability to bind specifically to an inorganic surface provide important advantageous for constructing multifunctional systems which inspired from natue. These short amino acid sequences serve as linker molecules in order to realize striking nanobiotechnological applications. GEPIs fused proteins serve as multifunctional biomolecules which overcome limitations of traditional immobilization techniques. In this dissertation, alkaline phosphatase enzyme fused to a genetically enginneered gold binding peptide with five tandem repeat (5GBP1-AP) was used for real time monitoring of calcium phosphate biomineralization. Calcium phosphate as being the main component of hard tissues such as bone and teeth is a crucial biomineral which is found in different crystal structures in both vertebrates and invertebrates. Calcium phosphate is widely studied in order to shed light of its formation and crystal phase transitions that are important for theoretically and practically for medical applications. Alkaline phosphatase has the ability to catalyze the hydrolizing reaction of phosphate containing molecules result to release inorganic phospahate group to the environment. For this reason, it is used in mineralization studies to mimic this function for biomineral formation. Surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy is a very sensitive characterization method to analyze molecular interactions in real-time. In addition SPR serve as valuable technique to study protein interactions with solid surface that is commonly gold substrate. GEPI fused alkaline phosphate which have high affinity to gold surafec was analyzed by SPR in order to progress biomineral formation in real-time. The advantage of this method is the ability to provide both monitoring of calcium phosphate formation in real-time and analyzing gold binding property of bifunctional enzyme. In addition GEPI fused AP was found to have higher enzymatic activity according to wild type enzyme. Results indicated that 5GBP1-AP induced biomineral formation upon adsorption onto gold substate and allow to progress biomineral formation by surface plasmon resonance spectroscopy. SPR results are thought to be promising with the possible indications about the crystal phase transition of calcium phosphate which is a long debated issue about biomineralization.