Katyonik Polimerlerin Gen Taşıyıcı Sistemleri Olarak Değerlendirilmesi

Abstract

Gen tedavisi, genetik kaynaklı birçok hastalığa çözüm sunma potansiyeli açısından son yıllarda oldukça rağbet gören bir çalışma alanı olmuştur. Gen tedavisinin ana amacı hastalıkların ortaya çıkardığı semptomları iyileştirmeye çalışmak yerine, hastalığa sebep olan genetik bozuklukları ortadan kaldırmaktır. Bu tedavide, tedavi edici özelliği olan genler, en güvenli ve verimli bir taşıyıcı ile hedef dokuya ya da hücreye transfer edilmektedir. Bu amaçla kullanılan taşıyıcılar viral ve viral olmayan taşıyıcılar olmak üzere ikiye ayrılır. Viral taşıyıcılar, hedefe ulaşma verimliliği açısından bilinen en verimli taşıyıcılar olmakla birlikte güvenilirlik ve üretim aşamaları açısından uygulamaları çok kısıtlıdır. Bu sebeple, güvenli ve üretimi kolay alternatif bir metod olarak katyonik polimerler araştırılmaktadır. Literatürde, katyonik polimerlerin transfeksiyon verimliliklerini artırmak için yapılmış pek çok çalışmaya ulaşılabilir. Bu tez çalışmasında, gen tedavisi potensiyelleri açısından iki farklı polimer türü sentezlendi ve çeşitli özellikleri bakımından incelendi. Bu polimerlerin ilki, katyonik fakat biyobozunur olmayan poli(2-(dimetilamino)etil metakrilat) (pDMAEMA) polimeridir. İkinci tür taşıyıcı sistem ise katyonik ve biyobozunur disülfür bağı içeren, lineer poli(amidoamin) (SS-PAA) polimer türevleridir. SS-PAA ailesine ait farklı yan grup ve kaplama stratejileri ile sentezlenen 4 farklı polimer bu çalışmada incelendi. Bunlar poli-(N,N’-sistamin bisakrilamit-4-amino bütanol) p(CBA-ABOL), PEG’leme stratejisi ile geliştirilen p(CBA-ABOL/DMEDA/PEG), hiyaluronik asit (HA) kaplanmış p(CBA-ABOL) ve son olarak da poli-(N,N’-sistamin bisakrilamit-histamin) (p(CBA-HIS))’dir. Bu çalışmanın ilk aşaması olarak farklı molekül ağırlıklı ve farklı polimer oranlarına sahip polimer/pDNA (plazmit DNA) kompleksleri (polipleks) fizikokimyasal özellikleri açısından incelendi. Bu amaçla boyut, polidispersite ve yüzey yükü ölçümleri DLS cihazı ile yapıldı. İkinci olarak poliplekslerin pDNA’yı kaplayarak kararlı kompleksler oluşturma etkinlikleri agaroz jel elektroforez ile belirlendi. Bu karakterizasyonları takiben, polimer/pDNA komplekslerinin ARPE-19 hücreleri ile in vitro biyolojik değerlendirmeleri amaçlandı. Farklı molekül ağırlığına (MA) ve farklı polimer oranlarına sahip polipleksler hazırlanarak hücrelere transfer edildi ve hücre içine alınma ve genetik materyali hedefe ulaştırma verimlilikleri Hücre Sitometresi (Flow Cytometry) cihazı ile ölçüldü. Son olarak, poliplekslerin hücreler üzerindeki sitotoksik etkisi MTT Testi ile analiz edildi. pDMAEMA polimeri ile oluşturulan 2 farklı MA ve farklı polimer oranına sahip poliplekslerin HEPES tamponu ortamında yapılan boyut ve yük tayini sonuçlarına göre bu ortamda pDNA ile kararlı komplekler yapabildiği görüldü. Yapılan ölçümlerin fizyolojik ortama uygunluğunun denenmesi için aynı seri ölçümler bir de serum içermeyen transfeksiyon ortamı olan OptiMEM ortamında gerçekleştirildi. OptiMEM ortamında kompleks kararlılığının azaldığı ve agregasyon oluşumu gözlendi. Bu ölçümleri takiben pDMAEMA polimerinin pDNA’yı kondanse edebilme özelliğinin analizi için pDMAEMA polipleksleri agaroz jel elektroforeze uygulandı. Her iki MA ve polimer oranındaki kompleksler pDNA kaplamaya muktedirdi. Polimer MA ve oranının polipleks kararlılığına bariz bir etkisinin olmadığı gözlendi fakat yüksek polimer oranına sahip kompleksler daha küçük parçacık boyutu gösterdiler. pDMAEMA poliplekslerinin in vitro biyolojik değerlendirilmesi sonuçlarına göre pDMAEMA/pDNA komplekslerinin hücre içine alınma verimlilikleri oldukça tatmin ediciydi. Fakat hücre içine alınan poliplekslerin çekirdeğe ulaşma potansiyelleri oldukça düşük ve ancak hücreler için toksik olan polimer miktarlarında ilgi çekici sonuçlar verdi. SS-PAA polimerleri içerdikleri tekrarlanan sülfür köprüleri sayesinde biyobozunur polimerler olduklarından gen salımı konusunda iyi bir potansiyele sahiptirler. Bu ailenin ilk üyesi olarak p(CBA-ABOL) polimeri gen taşıyıcısı olarak değerlendirildi. pDMAEMA polipleksleri için yapılan tüm işlemler p(CBA-ABOL)/pDNA komplekleri için de denendi. Farklı polimer oranlarıyla oluşturulan p(CBA-ABOL) komplekslerinin yüzey yükü ve boyut tayini HEPES ve OptiMEM ortamlarında gerçekleştirildi. HEPES ortamında artan polimer miktarının daha kararlı kompleksler oluşturmasına karşılık, aynı komplekslerde OptiMEM ortamında agregasyon gözlendi. Agaroz jel elektroforez sonuçlarına göre yüksek polimer oranları 48/1 ve 96/1 ile oluşturulan kompleksler pDNA’yı kaplama açısından daha elverişli idiler. p(CBA-ABOL) poliplekslerinin in vitro biyolojik değerlendirilmelerinin sonucunda ise p(CBA-ABOL) poliplekslerinin genetik materyalin hücre içine alınması ve ardından çekirdeğe ulaştırılması açısından pDMAEMA komplekslerine göre daha verimli olduğu ayrıca ARPE-19 hücreleri için yalnızca ihmal edilebilir düzeyde bir toksisiteye sebep olduğu görüldü. p(CBA-ABOL) komplekslerinin fizyolojik ortamdaki agregasyonunu engellemek amacıyla evrensel bir strateji olan PEG’leme stratejisi kullanıldı. PEG’lenen p(CBA-ABOL) polimeri ile oluşturulan kompleksler de daha önceki ölçümlere tabi tutuldu. PEG’leme sonucunda komplekslerin OptiMEM ortamındaki kolloidal kararlılığında artış gözlenirken in vitro biyolojik değerlendirme açısından PEG’lenen p(CBA-ABOL) polimeri ile yapılan ölçümler istenilen verimi göstermedi. Hücre içine alınma verimliliği açısından PEG’lenmiş komplekslerin yok denecek kadar az bir potansiyellerinin olduğu gözlendi. Kompleksler hücre içine alınmadığından sitotoksisite analizine gerek duyulmadı. p(CBA-ABOL) komplekslerinin hücre içine alınma kapasitelerinin artırılması için kompleksler bir hücre zarı proteini olan HA ile elektrostatik olarak farklı HA/pDNA oranlarında kaplanarak önceki polimerler ile aynı şekilde fizikokimyasal ve biyolojik değerlendirmelere tabi tutuldu. Komplekslerin dış kabuğu anyonik HA ile kaplandığından yüzey yükünün pozitiften negatife döndüğü gözlendi. Parçacık boyutu ve kolloidal stabilite açısından ise kaplanmamış p(CBA-ABOL) komplekslerine göre OptiMEM ortamında daha kararlı kompleksler elde edildi. Biyolojik değerlendirme sonuçlarında, poliplekslerin hücre içine alımında HA kaplama ile elde edilmek istenen artış gözlenmedi. En son taşıyıcı sistem olarak SS-PAA polimerlerinin bir türevi olan p(CBA-HIS) polimeri ile oluşturulan kompleksler gen taşıma kapasiteleri açısından değerlendirildi. HIS yan grubu, ABOL yan grubuna göre daha asidik olduğundan komplekslerin hücre içine endozomlar vasıtasıyla alınmasını takiben endozomlardan çıkışı artıracağı ve buna bağlı olarak çekirdeğe ulaşan kompleks miktarının artacağı amaçlandı. p(CBA-HIS) kompleksleri kolloidal karalılık ve pDNA kondenzasyonu açısından p(CBA-ABOL) kompleksleri ile benzer özellikler gösterdiler. Aynı şekilde in vitro ölçümler sonucuda p(CBA-HIS) komplekslerinin hücre içine alınma kapasitelerinin daha yüksek olmasına rağmen genetik materyalin çekirdeğe ulaşma verimliliği açısından amaçlanan artış gözlenmedi. Sonuç olarak pDMAEMA polimer/pDNA komplekslerinin artan molekül ağırlıkları ve polimer miktarları hücreler üzerinde toksik etki yaparken, SS-PAA polimerlerinin transfeksiyon açısından iyi bir potansiyellerinin olduğu tespit edildi. Bu gruptan son olarak incelenen p(CBA-HIS) poliplekslerinin HEPES tamponu ortamında pDNA’yı kondanse etmesi ve transfekte ettiği hücreler üzerinde sitotoksik aktivite göstermemesine rağmen agregasyon oluşumu tamamen engellenemedi. Bu nedenle bu poliplekslerin fizyolojik şartlardaki davranışlarının daha ileri araştırmalarla incelenmesi gerekmektedir.

Gene therapy has been a promising way to treat human genetic disorders. The major goal of gene therapy is to repair the genetic cause underlying the disorder by transferring the therapeutic nucleic acid with a safe and efficient carrier. For this purpose, two main classes of vectors are explained: viral and non-viral vectors. Even though, viral vectors are the most efficient carriers known, they have restrictions about their safety and production process. Cationic polymers have been the mostly investigated non-viral vector systems as a safe and easy-to-produce alternative to viral carriers. Moreover, numerous research have been done to increase their transfection efficiency. In this thesis study, two different types of cationic polymers were synthesized and investigated for their non-viral gene carrier potentials. One of them is a cationic, non-biodegradable poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) (pDMAEMA). The second type of carriers is cationic and biodegradable linear, disulfide linkage containing poly(amidoamine)s (SS-PAAs) that include four different polymers with different side groups and coating strategies. The SS-PAA family consists of p(CBA-ABOL), p(CBA-ABOL/DMEDA/PEG) with PEGylation strategy, p(CBA-ABOL) with HA-coating and lastly, p(CBA-HIS). The main objectives of this study were first of all, physicochemical characterization of the polymer/pDNA complexes with different polymer Mw and polymer/pDNA ratio in terms of size, polydispersity and surface charge which were measured by DLS. Secondly, the pDNA complexation ability of polyplexes was investigated by performing agarose gel electrophoresis. Thirdly, in vitro biological evaluation of polymers on ARPE-19 cells were performed. For this purpose, uptake and transfection efficiencies of the polymers and the effect of different polymer Mw’s and different polymer/pDNA ratios on uptake and transfection efficiency of polyplexes were evaluated by Flow Cytometry. Finally, the effect of polyplexes on the viability of ARPE-19 cells was analyzed with MTT Assay. While evaluating the pDMAEMA complexes, they showed the ability to form stable complexes in HEPES buffer and were able to efficiently complex pDNA. Nevertheless, the cationic nanoparticles formed with these polymers only exhibited signs of transfection in concentrations already toxic for the cells. This is why a new family of biodegradable polymers- the disulfide-containing PAAs, were investigated. p(CBA-ABOL) particles were also able to form stable polyplexes with efficiently complexed pDNA and also showed very high transfection efficiency, without significant effect on cell viability. Unfortunately, these nanoparticles were not stable in mimicked physiological conditions, which is why the same polymer was investigated with a PEG-chain as a universal coating strategy. Even though these particles were stable under physiological conditions, their uptake was drastically hindered. A different coating strategy with hyaluronic acid showed promising preliminary results, but the same results could not be observed with the research grade purity low Mw HA. Subsequently, another member of SS-PAA family with a different side chain and buffering capacity was evaluated. p(CBA-HIS) polymer was able to condense the pDNA in HEPES buffer and transfected the cells with almost no cytotoxic effect. However, the colloidal stability of p(CBA-HIS) polyplexes in physiological conditions should be further increased.