Aktif Çamurun Pha Depolama Yeteneğinin Ve Mikrobiyal Çeşitliliğinin Farklı İşletme Koşulları Altında Karşılaştırmalı Olarak Değerlendirilmesi

Abstract

Biyolojik olarak üretilen ve biyolojik olarak tümüyle ayrışabilir nitelikte poliesterler olan Polihidroksialkanoatlar (PHA) daha sürdürülebilir olduklarından, plastik dediğimiz sentetik polimerlerin yerini almaya adaydırlar. Biyoloplastiklerin yaygın olarak üretilmelerinin önündeki en büyük engel yüksek üretim maliyetleridir. Aktif çamur gibi karışık mikrobiyal kültürlere dayalı sistemler sterilizasyon gerektirmemeleri ve bakterilerin atıksu gibi karışık ve ucuz besinlere kolayca uyum sağlamaları nedeni ile bu sistemlere dayalı PHA üretimi düşük maliyetli bir olasılık olarak belirmekte ve bu konudaki araştırmalar sürmektedir. Yüksek depolama özelliğine sahip mikroorganizmaların seçilmesi, rekabet şansı yüksek bir PHA üretim sisteminin geliştirilmesi açısından hayati olduğundan, farklı zenginleştirme stratejilerinin PHA üretimine ve popülasyon dinamiklerine etkisinin anlaşılması bir zorunluluktur. Bu çalışmada, biyokütle zenginleştirmek amacıyla aerobik dinamik besleme (ADB) koşullarında üç ardışık kesikli reaktör (AKR) işletilmiş ve AKR çevrimi süresince azot varlığının popülasyon dinamiklerine ve seçilen biyokütlenin depolama yeteneğine etkisi araştırılmıştır. Reaktörlerden birinde azot daima mevcutken, diğer reaktöre beslenen sentetik atıksudaki azot konsantrasyonu, bolluk fazının sonunda karbon ile birlikte bitecek şekilde ayarlanmıştır. Üçüncü reaktör ilk defa bu çalışmada önerilen ve gecikmiş azot besleme (GAB) olarak adlandırılan bir yöntemle beslenmiştir. Azot ve karbonun bir arada bulunmalarının engellenmek istendiği bu besleme rejiminde, azot içermeyen bir sentetik atıksu reaktöre beslenmiş ve azot çözeltisi ancak reaktördeki bütün karbon kaynağı tüketildikten sonra sisteme beslenmiştir. Reaktör işletimleri sırasında biyokütlelerin polimer depolama yeteneğindeki değişimler spesifik polimer depolama hızı, substratın polimere dönüşüm oranı, depolanan polimer miktarı ve biyokütlenin polimer içeriği göz önünde bulundurularak değerlendirilmiştir. ADB koşullarında seçilen biyokütlelerin polimer depolama yeteneklerinin aşı çamurununkine göre oldukça yüksek olduğu tespit edildi. Sisteme beslenen tek karbon kaynağı asetat olduğu için beslenen substrat polihidroksibütirat (PHB) biçiminde depolanmıştır. Deney sonuçları göstermiştir ki, biyokütle zenginleştirilirken, substrat alımı sırasında reaktördeki azotun sınırlandırılması polimer depolanmasını olumlu yönde etkilemiştir. Dolayısıyla GAB’nin uygulandığı dinamik şartlarda zenginleştirilmiş olan biyokütlenin polimer içeriğinin, bu biyokütle için elde edilen dönüşüm oranı ve polimer depolama hızının azot kısıtlamalı olarak zenginleştirilen biyokütle için elde edilen değerlerden daha yüksek, azot kısıtlamasız olarak zenginleştirilen biyokütle için elde edilen değerlerden de çok daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Biyokütlenin türsel yapısı klon kütüphanesi ve sekans analizi ile belirlenmiştir. Farklı işletme koşullarında zenginleştirilen biyokütlenin bakteriyel popülasyonundaki değişimler ise 16S rRNA üzerine kurulu denaturan gradyent jel elektroforezi (DGJE) analizi yöntemi ile izlenmiştir. Klon kütüphanesinde mevcut türlerin %94’ünün temsil edildiği belirlenmiştir. Aşı çamurunu oluşturan bakteriyel topluluk, farklı türleri içerisinde barındıran zenginlikte ve heterojen bir yapıdadır. Proteobacteria aşı çamuru içerisindeki en baskın şubedir. Klon kütüphanesinin %14,5’i α-proteobacteria ve %53’ü de β-proteobacteria sınıflarından oluşmaktadır. Çamurda tespit edilen bakteriyel türlerin %14,5’inin Verrucomicrobiae, %13,3’ünün Bacteroidetes ve %4,8’inin de Planctomycetes şubelerine ait olduğu belirlenmiştir. Klonların %42,2’sinin en baskın şube olan β-proteobacteria’ya bağlı Rhodocyclaceae ailesinden oldukları tespit edilmiştir. AKR işletimi sırasında türlerin bağıl çokluğundaki değişimler yarı niceliksel bir yöntem olan DGJE ile belirlenmiştir. DGJE sonuçlarının istatistiksel analizi göstermiştir ki; her bir türün bağıl çokluğundaki değişiklikler önemli olmakla birlikte, tespit edilen türlerin sayısında önemi bir değişiklik gözlenmemiştir. Her bir AKR’deki bakteriyel çeşitlilikte gözlenen değişim farklılık gösterse de β-proteobacteria’nın Rhodocyclaceae ailesin’e bağlı türler özellikle de Zoogloae her üç reaktörde de sürekli baskın olmuştur. Bakteriyel topluluğun yapısındaki değişiklikler ile biyokütlenin depolama yeteneğindeki değişim arasındaki ilgileşim istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Planctomycetes ve Bacteroidetes şubelerine bağlı türlerin PHA depolamasına katkısının önemsiz olduğu tahmin edilmektedir. Gecikmiş azot beslemenin uygulandığı AKR için elde edilen ilgileşim değerleri diğer iki reaktör için elde edilenlerden daha küçüktür. Seçilen biyokütlelerin farklı şartlar altındaki tepkilerini gözlemek amacıyla farklı substratların, substrat yüklemelerinin ve karbon/azot (C/N) oranlarının denendiği çeşitli kesikli deneyler gerçekleştirilmiştir. Farklı azot besleme rejimleri ile zenginleştirilmiş üç biyokütle tarafından depolanan polimer konsantrasyonu da artan substrat yüklemesine bağlı olarak artmış fakat en yüksek konsantrasyon, gecikmiş azot besleme ile zenginleştirilmiş biyokütle için elde edilmiştir. Elde edilen en yüksek biyokütle polimer içeriği %47,1 olup bu değer de gecikmiş azot besleme ile zenginleştirilmiş biyokütle için elde edilmiştir. Polimer depolama hızı ile yüklenen substrat arasındaki ilişkinin, kesikli deney sırasında reaktörde azot bulunup bulunmadığına yakından bağlı olduğu tespit edilmiştir. Azotsuz olarak gerçekleştirilen deneylerde artan substrat yüklemeleri spesifik polimer depolama hızında artışa yol açarken, azotla gerçekleştirilen deneylerde bu durum depolama hızında düşüşe yol açmıştır. Substratın polimere dönüşüm oranı her üç biyokütle için de artan substrat yüklemesine bağlı olarak düşmüştür. En yüksek dönüşüm oranı (0,71), gecikmiş azot besleme ile zenginleştirilmiş olan çamur için ve en düşük substrat yüklemesinin uygulandığı deneyde elde edilmiştir. Reaktöre beslenen substrat konsantrasyonunun arttırılması, azot konsantrasyonu sabit tutulması durumunda dönüşüm oranında bir artışa, C/N oranının sabit tutulması durumunda da dönüşüm oranında azalmaya yol açmıştır. AKR işletimi sırasında ve bu reaktörden alınan çamur ile gerçekleştirilen deneyler sırasında uygulanan koşullar arasındaki uyumun polimer depolamasına olumlu yönde etki eden bir etken olduğu belirlenmiştir. Substrat olarak asetat propiyonat karışımının kullanıldığı deneylerde polimer daha çok hidroksibütirat (HB) ve hidroksivalerat (HV) kopolimeri şeklinde depolanmıştır. Aynı şartlar altında gecikmiş azot beslemesi yöntemiyle zenginleştirilmiş biyokütle tarafından depolanan PHV, azot kısıtlı olarak zenginleştirilen biyokütlenin depoladığından daha fazla, azot kısıtsız olarak zenginleştirilen biyokütlenin depoladığından ise çok daha fazladır. Genel olarak, ilk defa bu çalışmada önerilen bir proses olan gecikmiş azot besleme ile zenginleştirilmiş biyokütlenin polimer depolama yeteneğinin, azot kısıtlı ve azot kısıtsız şartlarda gerçekleştirilen aerobik dinamik besleme ile zenginleştirilmiş biyokütlelerin depolama yeteneğinden daha üstün olduğu belirlendi. Eğer bu proses optimize edilirse ve çözünmüş oksijen kontrollü besleme gibi yöntemlerle kombine edilirse, saf kültürler kullanılarak gerçekleştirilen endüstriyel PHA üretimi karşısında güçlü bir alternatif olabilir. Nütrient yönünden fakir organik atıklar fermentasyondan sonra bu proseste ucuz karbon kaynağı olarak kullanılabilirler.

Polyhydroxyalkanoates (PHAs), which are biologically-derived and completely biodegradable polyesters, represents a potentially sustainable substitution to synthetic polymers known as plastics. Currently, high production and recovery costs are the main limitations for the bulk production of bioplastics. PHA production processes based on mixed microbial cultures, such as activated sludge systems, are being investigated as a possible technology to decrease production costs. In activated sludge systems no sterilization is required and bacteria can adapt quite well to the complex and cheap substrates, such as wastewaters. To understand the impact of different enrichment strategies on PHA production, and population dynamics is an obligation because selection of organisms with high storage ability is one of the most critical factors having effect on development on the competitive process for PHA production based on mixed cultures. In this study, three sequencing batch reactors (SBR) were operated under aerobic dynamic feeding (ADF) conditions for biomass enrichment in order to investigate the effect of nitrogen (N) availability during a SBR cycle, on population dynamics and PHA accumulation ability of selected biomass. Nitrogen was always available in one of the reactors, whereas, in the second SBR, it was depleted completely together with carbon source at the end of feast phase. The third SBR was operated with delayed nitrogen feeding (DNF) strategy which was proposed in this study. In this feeding regime, synthetic wastewater without nitrogen was fed to the SBR and nitrogen source was fed to the reactor following substrate depletion to hinder being substrate and ammonia simultaneously in the reactor. Changes in polymer storage ability of three biomasses were determined in terms of specific polymer storage rate, yield of polymer on substrate consumed, amount of polymer accumulated, and biomass polymer content. Polymer storage ability of biomasses enriched under ADF conditions were considerably higher when compared to those obtained for inoculum sludge. Substrate was accumulated mainly in the form of Polyhydroxybutyrate (PHB) because acetate was supplied as the sole carbon source. Experimental data showed that nitrogen restraint throughout biomass enrichment stimulated polymer accumulation. Accordingly, polymer content of biomass enriched under dynamic conditions with DNF and also polymer yield and polymer uptake rate obtained for this biomass was higher than those obtained for biomass enriched under dynamic conditions with nitrogen deficiency, and considerably higher than those obtained for biomass enriched under dynamic conditions without nitrogen deficiency. Community structure of biomass determined clone library construction and subsequent analysis of clone sequences. Changes in bacterial population of biomasses being enriched under different operating conditions were monitored by denaturing-gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of clone sequences based on 16S ribosomal Ribonucleic acid (rRNA). According to rarefaction analysis, 94% of the species were determined. The bacterial community of the inoculum sludge was consisted of a heterogeneous microbial community, rich in different bacterial species. Proteobacteria dominated in the inoculum sludge bacterial clone library with 14.5% belonging to α-proteobacteria, and 53% belonging to β-proteobacteria. Proteobacteria followed by Verrucomicrobiae (14.5%), Bacteroidetes (13.3%) and Planctomycetes (4.8%). Among the members of β-proteobacteria class, Rhodocyclaceae (42.2%) was the most predominant family represented by clones. Changes in relative abundances of these species during operation of SBRs were monitored by a semi-quantitative method, DGGE. Statistical analysis of results obtained from DGGE indicates that changes in relative abundance of bacterial species in the activated sludge were more significant than changes in number of species during SBR operations. Although changes in bacterial diversity during operation of three SBRs were different in details, species belonging to Rhodocyclacea family in Betaproteobacteria phylum and especially Zoogloea genus was always predominant in three reactors. Correlation between changes in community structure and PHA storage ability was statistically evaluated. It is concluded that contribution of the species belonging to phyla Planctomycetes and Bacteroidetes to PHA accumulation were paltry. Relatively lower correlations were obtained for delayed nitrogen feeding process. Various batch experiments were conducted by feeding different types of substrate and applying various substrate loadings, and carbon to nitrogen (C/N) ratios, in order to investigate responses of biomasses under different conditions. Results obtained from batch experiments showed that concentrations of polymer accumulated by three different sludges increased directly with substrate loading (S/X) and the highest polymer accumulation was obtained for the biomass enriched under delayed nitrogen feeding conditions. The highest sludge polymer content, 47.1% on COD basis, was also obtained for the biomass enriched under these conditions. Relation between polymer storage rate and substrate loading was determined to depend strongly on nitrogen availability during batch test. Substrate loading caused an increase in the specific polymer storage rate during the batch tests where nitrogen does not exist, however it caused a decrease in specific polymer storage rate if nitrogen is available. Yield of polymer on substrate consumed decreased directly with substrate loading for three different sludges. The highest polymer yield (0.71) was obtained during batch tests performed with sludge enriched with delayed nitrogen feeding and the lowest substrate loading applied. Polymer yield increased with substrate concentration if nitrogen concentration kept constant and decreased with substrate concentration if C/N ratio kept constant. Harmony between conditions applied during SBR operation and batch experiments was also determined to be an important factor affecting polymer storage. Substrate was accumulated mainly in the form of hydroxybutyrate (HB) and hydroxyvalerate (HV) when a mixture of acetate and propionate was supplied. Amount of PHV accumulated by the sludge enriched under delayed nitrogen feeding conditions was higher than that accumulated by sludge enriched under nitrogen deficient conditions and noticeably higher than that accumulated by sludge enriched without nitrogen deficiency. Generally restriction of nitrogen availability during substrate uptake improved polymer storage ability of biomass. Among the three different enrichment strategy, DNF process, which was proposed for the first time in this study, was found to be the most effective one. If this process optimized and combined with other strategies, such as pulsewise feeding control, it can be a stronger alternative to industrial production of PHAs achieved by pure cultures. Ammonia deficient organic wastes can be used as a cheap carbon source in this process for PHA production after a fermentation process.