Yvfı-sinr Proteinleri Tarafından Birlikte Düzenledikleri Genlerin Belirlenmesi Ve Deg-u Transkripsiyon Faktörünün Bacillus Subtilis’deki Yvfı Gen Ekspresyonuna Etkisi

Abstract

Gram pozitif bakteriler arasında yer alan Bacillus subtilis, çubuksu yapısı,patojen özellikte olmaması ve sporlanabilmesi gibi öne çıkan özellikleriyle tanımlanan bir bakteri türüdür. Bu bakteriye günlük yaşantımız içinde toprakta sıklıkla rastlamak mümkündür. B.subtilis rakipleriyle mücadele edebilme konusunda birçok avantaja sahiptir. On ikiden fazla çeşitlilikte antibiyotik üretebilmesi en çarpıcı özellikleri arasındadır. Bunun yanı sıra sahip olduğu kemotaksis kabiliyetinin sonucu olarak katı yüzeylerde kayarak yer değiştirebilmesi, olumsuz şartlarda sporlanabilmesi ve kompetans geliştirebilmesi B. subtilis türünü rakipleriyle mücedelesinde öne çıkaran avantajlar arasındadır. Bacillus subtilis, genomunun tamamı dizilenmiş bir organizmadır. Ayrıca patojen özellikte olmaması sebebiyle kolay kontrol edilebilir bir türdür. Bölünme ve büyüme hızı, kolay transforme olabilme yeteneği, yüksek adaptasyon kabiliyeti, çeşitli antibiyotikleri, enzimleri ve biyokimyasalları üretebilmesi sayesinde bilimsel araştırmalarda sıklıkla yer alan bir model organizmadır. 4,2 Mbp uzunluğundaki genomunun tamamının dizilenmesi sonucunda, organizma genomunun yaklaşık olarak 4,100 genin kodlanmasından sorumlu olduğu görülmüştür. Bu genlerin haritalanması ile türe özgü fonksiyonların gerçekleştirilmesinden sorumlu olan kısmın, toplam bakteri genomunun üçte birlik bir kısmı olduğu anlaşılmıştır. Haritadaki geri kalan üçte ikilik kısmın sahip olduğu fonksiyonları aydınlatma amacıyla yapılan çalışmalar hala sürmektedir. Bacillus subtilis bulunduğu ortamdan gelen sinyallere ve ortamdaki bileşenlerin sağladığı büyüme şartlarına paralel olarak fizyolojik değişimler sergileyebilen bir bakteridir. Bu bakterinin sahip olduğu gelişmiş adaptasyon kabiliyeti sayesinde geçirdiği değişimler, morfolojik ve fenotipik açıdan net yansımalar gösterir. B. subtilis’i fizyolojik açıdan değişime teşvik eden sebepler arasında, ortamdaki besin kaynaklarının kullanılabilirliği ve diğer organizmalarla besin kaynaklarına karşı olan rekabet, ortamın sıcaklığı, pH değeri ve oksijen miktarının bakterilerin optimum değerlerinin dışında olması ve bakterilerin büyüme hızındaki değişiklikler sayılabilir. Örnek vermek gerekirse, logaritmik büyüme evresinin sonlarına gelmiş ve besin kaynaklarında azalmayla karşılaşmış bir bakterinin kemotaksis metabolizması uyarılır ve canlılığını sürdürebilmek için çeşitli stratejiler geliştirmeye zorlanır. Bu kıtlık durumu devam ederse, hareket ederek besin bulmayı hedefleyen bakteride, bu sefer de ortamdaki diğer mikroorganizmaları bu yarıştan uzaklaştırmak için antimetabolik, antifungal ve antimikrobiyal özellikteki antibiyotiklerin üretimi tetiklenir. Bu besin kıtlığıyla baş edebilme çözümlerine ek olarak, aynı şekilde ortamdaki besin seviyesinde azalma söz konusu olduğunda, farklı besinleri kaynak olarak kullanabilmek için proteaz üretimine, kompetans geliştirerek yabancı DNA’nın hücre içine alımına ya da sporlanmaya yönelebilen B. subtilis, olumsuz şartlarda geliştirdiği çeşitli mekanizmalarla hayatta kalmayı başarabilen bir mikroorganizmadır. B. subtilis’ in genomunun tamamının dizilenmesiyle ortaya çıkan diğer özellikler de, üretebildiği ikincil metabolitler arasında antibiyotiklerin ve sanayileşme açısından önemli olan enzimlerin de olmasıdır. Bu özelliklere ek olarak, bu mikroorganizmanın karbon kaynaklarının kullanımındaki çeşitlilik de göze çarpmaktadır. Hatta, 10’a yakın profaj ve benzeri yapının B. subtilis’in genomu tarafından kodlanabildiği tespit edilmiştir. Bu sayede de bakteriyel evrim sürecinde bakteriyofaj enfeksiyonlarının gerçekleşebileceği gen transferinde etkili olabilmeleri söz konusu olabilir. Ayrica, mikroorganizmanın sahip olduğu 77 aday ATP-bağlayıcı taşıyıcı proteinden oluşan en büyük gen ailesi ve buna benzer diğer büyük gen ailelerinin varlığının gen duplikasyonları sonucu oluştuğu düşünülmektedir. Prokaryotlarda sinyal iletim mekanizması, sinyal reseptörleri ve gelen bu sinyallere cevap verebilecek özellikteki kısımlardan oluşur. Sarmal-dönüş-sarmal (helix-turn-helix) bölgesi ise fonksiyonel çıktı bölgesinin önemli bir kısmını karşılamaktadır. DNA’ya karşı afiniteye sahip ve bağlanabilme özelliğindeki kısımların dizilimlerindeki benzerliklerin oranı fonksiyonel sinyal algılayabilme ve bu sinyallere karşılık verebilme yetisindeki bölgelere sahip olan proteinlerdeki tek bileşenli sistemlerin ve HTH transkripsiyonel düzenleyicilerinin gruplandırılmasında belirleyici bir kriterdir. Bu transkripsiyonel düzenleyici proteinlerin farklı türleri mevcuttur. Bu türler arasında bulunan genel olarak kanatlı sarmal-dönüş-sarmal motifiyle tanımlanan GntR gen ailesi de vardır. Bu gen seti birbirinden farklı aksiyon bölgelerini ve farklı organizmalarda da işlevsellik gösterebilen 2000’e yakın farklı proteini barındırmaktadır. GntR ailesine ait 4 önemli altgruptan ilki ve en kalabalık olanı FadR alt grubudur. Bu alt grup benzer proteinlerin sahip olduğu fonksiyonlara ek olarak sahip olduğu geniş çeşitlilikle diğerlerinden ayrılmaktadır. Bu bilgilerin yanında aminoasit metabolizmasının düzenlenmesinin ve kontrolünün, aspartat, glukonat, laktat, galaktonat, pirüvat ve malonat gibi metabolik yol izlerinin FadR alt grubuna ait proteinlerle alakalı olduğu belirlenmiştir. Bu genlere ek olarak, yakın tarihte çalışılmış eski adı YvfI olan ve artık son çalışmalarda LutR olarak adlandırılan B. subtilis geninin, GntR ailesinin FadR altgrubunun C-ucu ligand bağlayan bölgesini içerdiği kanıtlanmıştır. Dahası bu gen B. subtilis’in ürettiği önemli bir antibiyotik olan basilisin üretiminde önemli bir rol oynamaktadır. Bacillus subtilis’e ait PY79 suşunun basilisin antibiyotiğinin üretim metabolizmasında da etkilidir. Bu metabolizmada etkili olan genlerin belirlenmesi amacıyla Tn10 mutagenesis çalışmaları gerçekleştirilmiş ve GntR ailesine ait YvfI transkripsiyonel regülatorünün basilisin üretiminde rol aldığı kanıtlanmıştır. Bu bulguya paralel olarak da YvfI geninin regülasyonundan sorumlu herhangi bir genin, dolaylı yoldan da olsa basilisin üretiminde regülatör rol üstlendiği yorumu yapılmıştır. Geniş bir spektrumda bakterilere ve bazı mantar türlerine karşı etki gösterebilme yeteneğine sahip dipeptit basilisin antibiyotiği C ucunda L-antikapsin ve N ucunda L-alanin’den oluşur. Basilisin antibiyotiği antimikrobiyal özelliğini doğal olarak protein özellikleri taşımayan L-antikapsin aminoasidinden alır. Yakın tarihli çalışmalarla, basilisin biyosentez mekanizması aydınlatılmış ve ywfBCDEFG (yeni ismisyle bacABCDE) polisistronik operonu ve ywfH monosistronik geniyle olan ilişkisi üzerinde durulmuştur. Yapılan çalışmalarla elde edilen sonuçlara bakıldığında, bacABCDE operonundaki bacA, bacB ve bacC genlerinin etki mekanizmasının antikapsin üretimi olduğu, bacD ve bacE genlerinin ise aminoasit ligasyonu ve basilisin antibiyotiğinin olumsuz etkilerine karşı dirençli olma mekanizmaları üzerinde etkili olduğu görülmüştür. Bunların dışında, 44 aminoasit daha içeren YvfI proteininin genişletilmiş formunun birebir olmasada GntR gen ailesine benzer proteinlerin içerdiği kanatlı sarmal-dönüş-sarmal bölgesiyle büyük oranda benzerlik gösterdiği keşfedilmiştir. Bütün bu bulguların ötesinde, henüz tamamlanmış çalışmalarla YvfI’ın baskın bir şekilde yvfV-yvfW-yvbY genlerinden oluşan lutABC operonunun kontrolünü üstlendiği görülmüştür. Bacillus subtilis’deki regülasyon mekanizmaları arasında önemli bir rol üstlenen birimlerden biri de Spo0A proteinidir. Bir global regülator olan Spo0A sporlanma sürecinin başlatılmasında üstlendiği kritik rolün yanısıra basilisin biyosentezi üzerinde de pozitif regülasyon etkisine sahiptir. Aynı zamanda AbrB ve CodY global geçiş fazı regülatorleri tarafından da logaritmik faz sürecinde baskılanabilmektedir. SinR proteini B. subtilis’in geçiş fazıboyunca etki gösteren önemli regülatörlerden biridir. Eksponansiyel büyüme esnasında ihtiyaç duyulmayan faaliyetlerin engellenmesinde rol alır. Ayrıca SinR’ın aşırı üretimi, negatif etki söz konusu olmaya başladığında sporulasyon mekanizmasını inhibe eder. Bunların dışında proteaz aktivitesi üzerinde negatif regülasyon etkisine sahiptir. SinR proteinin bir diğer özelliği de ComK proteininin negatif düzenlenmesinden sorumlu Rok proteinin transkripsiyonunu negatif olarak etkileyebilmesidir. Rok proteininin inaktif olması halinde SinR’ın ComK ekspresyonu esnasındaki rolü pozitif olarak düzenlenmiş olur. DegU proteini ise B. subtilis’deki bir diğer önemli regülasyon elemanıdır. Mikroorganizmanın sahip olduğu, geçiş fazı süreci veya besin kıtlığı gibi ekstrem durumlarla mücadele edebilmesini sağlayan; hücre dışında parçalayıcı etki gösteren enzim üretimi ve salınımı, kompetans oluşumu, biyofilm oluşumu gibi mekanizmaların indüklenmesini sağlayan regülatorlerden biri olan DegU proteini degU genitarafından kodlanır. Yapılan bu çalışmada, daha önceden grubumuzda uygulanan genom düzeyinde karşılaştırılmalı transkriptom analizi ve “Electromobility Shift Assay (EMSA) methodu” ile belirlenen YvfI transkripsiyonel faktörünün direkt kontrolü altında bulunan38 genin, regülatör bölgesi çoğaltılarak, YvfI and SinR proteinleri ile birlikte EMSA deneyleri yapılmış ve yorumlanmıştır. Bu genler ilgili oldukları alanlara göre, nitrojen metabolizması, karbonhidrat mekanizması, antibiyotik üretimi ve direnci, B. subtilis deki mobil genetik elementlerin düzenlenmesi, sporlanma, sporlanmanın ertelenmesi ve rekabet sonucu oluşan yamyamlık mekanizmaları, biofilm oluşumu mekanizması, fajlarla alakalı genlerin aktivasyonu ve potasyum alımına göre sınıflandırılmıştır. Sonuç olarak, YvfI regülator proteinin direk etkisi altında bulunan 38 gen bölgesinin aynı zamanda SinR regülator proteininin direk etkisi altında bulunduğu gösterilmiştir. Tüm bu verilere,YvfI proteininin SinR regülatör proteini ile birlikte hareket ederek, Bacillus subtilis türünün değişen çevre koşullarına uyum sağlamasını sağlayan mekanizmaları birlikte yönettiklerine işaret etmektedir. Bu çalışmalardan ayrı olarak önemli global regülatörlerden biri olan DegU proteinin YvfI geni üzerindeki direk etkisi yine aynı şekilde EMSA deneyleriyle tespit edilmiştir.

Bacillus subtilis is a rod-shaped gram positive, nonpathogenic bacterium. It has various skills that enable the adaptation of bacterium a high adaptability to harsh enviromental conditions. B. subtilis can synthesize antibiotics (bacilysin, surfactin etc.), release degradative enzymes (e.g. protease), undergo chemotaxis, sporulate and synthesize biofilm. Hence, it is able to sense unsuitable conditions and alternate its response. Its genome is 4,2 Mbp and completely sequenced and encode about 4,100 different genes. GntR family proteins are classified as a transcriptional repressor proteins which are responsible for the regulation of more than 2000 altered proteins. Moreover, numerous regulons which have different functions are under the control of these proteins which behave as regulators. According to the recent studies, YvfI is a novel gene belonging to B. subtilis which was reported to have a significant role in bacilysin biosynthesis. It contains a FadR C-terminal ligand binding (FCD) domain which is common in GntR family proteins. Additionaly, YvfI was proposed to regulate yvfV-yvfW-yvbY (lutABC) operon that is responsible for lactate utilization in Bacillus subtilis. SinR protein is known as a transition state regulator and it regulates the transcription of the roc gene negatively. Rok protein is responsible for negative regulation of ComK that encodes the competence transcription factor. Furthermore, when rok is inactivated, it bypasses the positive obligation of SinR for ComK expression. Moreover, SinR can inhibit potentially unsuitable functions during exponential growth if there is no need for these functions. Addition to YvfI and SinR proteins, DegU protein has also a regulatory effect on development of genetic competence. DegU and histidine protein kinase DegS play an active role in the synthesis of degradative enzymes at the onset of competence development. In this present study, 38 YvfI-target genes, which have been identified previously by employing a genome wide comparative transcriptome analysis and Electromobility Shift Assays (EMSA), were screened to analyze the overlap between YvfI and SinR DNA targets. For this, Electromobility Shift Assays were performed with increasing concentrations of purified SinR or YvfI alone and in the presence of both regulators in which the fixed amount of one of them was mixed with the increasing concentrations of the others. Subsequently, when these genes were clustered based on their known or presumed functions, YvfI and SinR appears to participate to the regulation of genes involved in various metabolic and physiological processes associated with the postexponential phase in B. subtilis including degradative enzyme production, antibiotic production and resistance, carbohydrate utilization and transport, nitrogen metabolism, phosphate uptake, fatty acid and phospholipid biosynthesis, protein synthesis and translocation, cell-wall metabolism, energy production, transfer of mobile genetic element, induction of phage-related genes, sporulation, delay of sporulation and cannibalism and biofilm formation. This study revealed a significant overlap between the YvfI and SinR targets, proposing a possible co-regulatory role of YvfI and SinR proteins by directly binding on the promoter regions of previously identified YvfI affected genes in order to provide the adaptation of B. subtilis cells to changing conditions. In this study the direct regulatory effect of DegU protein on YvfI gene was also studied by employing Electromobility Shift Assay (EMSA) analysis.