Cmfdh Enziminin Termostabilitesinin Geliştirilmesine Yönelik Hedef Bölgeler Üzerinde Bölgeye Özel Mutasyon Uygulamaları

Abstract

NAD+-bağımlı format dehidrogenaz enzimleri formatın karbondiokside oksidasyonunu katalizler ve aynı zamanda NAD+ molekülünün NADH molekülüne indirgenmesini de gerçekleştirir. Bu özelliklerinden dolayı FDH’ler oldukça pahalı olan ve NAD(P)H-bağımlı oksidoredüktazlar tarafından kullanılan bir koenzim olan NAD(P)H’in rejenerasyonunda yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak birçok avantajının yanında format dehidrogenaz enziminin endüstriyel uygulamalarda kullanımı, sıcaklığın 55°C’nin üstüne çıkması durumunda enzimin inaktive olması sebebiyle kısıtlıdır. Bu projede, Candida boidinii FDH ve Pseudomonas sp. FDH enzimlerinin kristal yapısı esas alınarak daha önce gerçekleştirilmiş homoloji modelleme çalışmalarının sonuçlarına göre elde edilen hedef bölgeler esas alınarak enzimin termostabilitesinin artırılmasına yönelik mutantlar bölgeye özel mutasyon yöntemiyle dizayn edildi. Bölgeye özel gerçekleştirilen amino asit değişikliklerinin orijinal enzimin stabilitesi üzerindeki etkileri, yükselen sıcaklıklar altında gerçekleştirilen kinetik çalışmalar sonucunda enzime ait termodinamik parametrelerin belirlenmesiyle analiz edildi. Elde edilen sonuçlara göre, M131A mutantının aktivitesinde düşüş görülmesine ve V139W mutantının aktivitesinde herhangi bir değişim göstermemesine karşın K301R ve V133I olmak üzere diğer iki mutantın stabilite değerlerinde kayda değer bir artış gözlenmiştir. Bunun yanında, hedef bölgelerdeki değişikliklerin ardından, V139W mutantının katalitik aktivitesinde bir artış gözlemlenirken, elde edilen diğer üç mutant için katalitik aktivitelerin düştüğü gözlemlenmiştir.

NAD+-dependent formate dehydrogenases catalyse the oxidation of formate anion into carbon dioxide, coupled with the reduction of NAD+ to NADH thus they are widely used to regenerate the expensive NAD(P)H coenzyme which is essential for all NAD(P)H-dependent oxidoreductases. Despite of its many advantages, FDH has an important disadvantage on industrial applications since it can be easily inactivated above 55°C. In this project, the thermostability of FDH from Candida methylica (cm) was aimed to be improved by site-directed mutagenesis strategy and mutants were creates according to the target sites defined with previous homology modeling studies of cmFDH based on Candida boidinii (cb) FDH and Pseudomonas sp. (pse) FDH crystal structure. Effects of amino acid changes on the wild-type enzyme was examined with kinetic studies under increasing temperatures and identification of the thermodynamic parameters. The study resulted with improved thermostability on two of the mutants, which are K301R and V133I. Additionally; after manipulation on defined residues, catalytic efficiency of the enzyme was seen as increased in the V139W mutant, while other three mutants resulted with reduced catalytic efficiency.