Basilisinin Bacillus Subtilis Yaban Suşu 3610 Üzerine Etkisi

Abstract

Bacillus subtilis sporlanabilen, patojen olmayan, çubuksu yapıya sahip bir bakteri türüdür. Ayrıca Gram pozitif bakteri türü olup, doğada özellikle toprakda yaygın olarak bulunurlar. Kemotaksis, katı yüzeyde kayma hareketliliği, kompetans gelişimi, antibiyotik üretimi ve sporlanma gibi, değisken çevre kosullarına karşı birden fazla şekilde tepki verebilme özelliğine sahiptirler. Hücre dışına pekçok parçalayıcı enzim salgılayabildikleri gibi, rakipleri ile mücadele edebilmek icin B. subtilis hücreleri 12 den fazla farklı antibiyotik sentezleyebilirler. B. subtilis PY79 gibi evcilleşmiş laboratuar suşları biyofilm yapma özelliğini yitirmişselerde, evcilleştirilmemiş Bacillus subtilis NCBI 3610 suşu sıvı veya katı yüzeylerde biyofilm yapabilme özelliği taşımaktadır. Bir yüzeyde koloniler halinde tutunarak yaşayabilen mikroorganizmaların oluşturdukları her tabaka biyofilm yapısının özelliklerini taşımamaktadır. Biyofilm, bakteriler tarafından oluşturulan, herhangi bir yüzeye, yapışmalarını sağlayan ve büyüme oranları ve gen transkripsiyonuna bağlı olarak farklı fenotip gösterebilen ve oluşturan mikroorganizmanın içinde gömülü olarak bulunduğu hücredışı polimerik maddeden (EPS) oluşmuş matriks olarak tanımlanmıştır. Biyofilm oluşum süreci hücre dışı sinyalin algılanması ile başlar. Bu hücre dışı sinyallere örnek olarak, mesela B. subtilis de üretilen, lipopeptid antibiyotik sürfaktin, biyofilm matriks bileşen genlerinin ekspresyonunu indükler. İlk başta, biyofilm oluşturacak hücreler hareketli yapıdadır (hücrelerde hareket özelliğinin, biyofilm oluşumu için ilk adım olduğu düşünülmektedir). Biyofilm matriksi EPS olarak da bilinen hücredışı polimerik maddelerden oluşmaktadır ve biyofilm içerisinde yaşayan mikroorganizmalar tarafından sentezlenen polisakkaridler biyofilmin ana komponentini oluştururlar. Ayrıca bu matriksin içinde proteinler, lipidler ve diğer biyopolimerler gibi makromoleküller de bulunmaktadır. Bu matriksi oluşturan faktörler iyi bilinse de, bu sürecin başlaması icin gerekli sinyaller cok az bilinmektedir. Antibiyotiklerin sadece antimikrobial aracı olarak hareket etmediği, belirli genlerin ifade edilmesini düzenleyerek molekülleri uyardığı uzun zaman önce keşfedildi. Subtilisin gibi bazi antimikrobiyal ajanlarin hücre yoğunluğu algılama sinyal molekülü olduğu ispatlanmış olsa da, cok sayıda antibiyotiğin antimikrobiyal etkileri dışında ki rolleri bilinmemektedir. Basilisin, geniş bir bakteri yelpazesi ve bazı mantarlara karşı aktif bir antibakteriyel ajan olan, L-anticapsin ile L-alanin’den oluşan, belirli Bacillus suşlari tarafından sentezlenen bir dipeptid antibiyotiktir. Basilisinin antimikrobiyal etkisi protein kökenli olmayan bir amino asit olan L-antikapsin tarafindan gerçekleştirilir. Basilisin biyosentezinin polisistronik operon ywfBCDEFG (yeni ismiyle bacABCDEF) ‘a bağlı olduğu ve monosistronik geni ywfH ile çok yakın olduğu kısa bir zaman önce keşfedildi. Bunu takiben, bu genler arasından, BacA, BacB, YwfG ve YwfH proteinleri antikapsin üretiminde görev aldığı, BacD proteininin, L-alanin ve L-antikapsinin ligasyonundan sorumlu olduğu, bir hücre transport proteini olan BacE proteininin ise, basilisin immünitesinden sorumlu olduğu gösterilmiştir. Bacillus subtilis’de basilisin biyosentezi; degredatif enzim üretimi, kompetens gelişimi, diğer Bacillus antibiyotiklerinin üretimi, sporlanma prosesi ile birlikte global hücre yoğunluğu sinyal regulasyon ağı tarafından düzenlendiği bulunmuştur. Bunun yanı, B. subtilis de sporlanma prosesinin başlatılmasında anahtar rolü oynayan global regülatör Spo0A basilisin biyosentezini pozitif yönde regüle ederken, global geçiş fazı düzenleyicileri AbrB ve CodY tarafından, logaritmik fazda baskılandığı ortaya çıkarılmıştır. Aynı zamanda basilisin biyosentezinin besinsel yönden fakir bir ortamda bakterilerin kıtlık ortamlarına adaptasyonunu sağlayan ve dört-beş fosforlu guanin nukleotid (ppGpp) moleküllerinin kontrolununu içeren “stringent” global kontrol sisteminin etkisi altında olduğuda gösterilmiştir. Her ne kadar basilisin biyosentezinin sentezleme mekanizması ve düzenlenmesi iyi bilinse de host organizmada basilisin’in rolü çok daha az bilinmektedir. Bu çalışmada öncelikle, biofilm oluşum koşullarında, basilisin üretemeyen mutant suşda, biyofilm matriks genleri, kemotaksis ve kayma hareketliligi genleri, ve bu prosesleri düzenleyen regülatör genlerin ifade etme seviyeleri incelenerek, basilisinim B. subtilis NCBI 3610 suş üzerindeki etkilerinin aydınlatılması hedeflenmiştir.Bu amaç doğrultusunda, öncelikle, hem ana suş B. subtilis NCBI 3610 hem de basilisin üretemeyen Bac- B. subtilis NCBI 3610, biyofilm oluşturma besi yeri olan MSgg katı besi yerinde 3 gün boyunca büyütülerek, 24, 48 ve 72 saat aralıkları ile hücreler toplanmış ve bu hücre örneklerinden total RNA izole edilmiştir. Gen ifade miktarlarını belirlemek çin, ters transkripsiyon kuantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPZR) yöntemi uygulanmıştır. Reaksiyon spesifitesi, erime eğrisi analizi aypılarak takip edilmiştir. 2-Cp method kullanılarak, relatif gen ekspresyon miktarları hesaplanmış ve Log2 değerleri alınmıştır. Sonuç olarak, hareketlilik ve kemotaksis genlerinin ekspresyonundan sorumlu alternatif sigma faktörü SigmaD(σD) kodlayan sigD geni, bununla uyumlu olarak kemotaksis genleri cheY ve cheB gen ekspresyonlarının basilisin yokluğunda bir hayli düştüğü bulunmuştur. Bu sonuçlarla uyumlu olarak biyofilm ve kayma hareketliliği için gerekli olduğu gösterilen surfaktin biyosentezinden sorumlu srfA operonunda gen ifadesinin, basilisin yokluğunda bir hayli düştüğü bulunmuştur. Biyofilm matriksini oluşturan yapısal genleri kodlayan eps operonu içinde yer alan epsD(yveN), epsO (yveO) ve epsK(yvfA) genlerinin de basilisin yokluğunda ifadelerinin azaldığı gösterilmiştir. Benzer şekilde, B. subtilis’de geçiş fazında yada besin kıtlığında, hücre dışı parçalayıcı enzim üretimini indükleyen, kompetans gelişimi ve biyofilm oluşumu için gerekli ana regülatörler arasında bulunan DegU proteinini kodlayan degU gen ifadesinin ve DegU regülonu içerisinde yer alan hücredışı alkalin serin proteaz kodlayan aprE genininde gen ifadesinin bir hayli düştüğü tespit edilmiştir. Elde edilen bu gen ekspresyonu verilerinin yanında ayrıca, basilisin üretemeyen mutant suş ile ana suş 3610 nun biyofilm oluşturma ve kayma hareketliliği özellikleri, katı besi yerinde analiz edildiğinde, basilisin üretemeyen mutant suşun biyofilm oluşturma ve kayma hareketlilik özelliğini tamamen kaybettiği gözlenmiştir. Biyofilm oluşturma kapasiteleri sıvı besi yerinde kıyaslandığında, basilisin üretemeyen mutant suşun hiç bir şekilde yüzeyde biyofilm oluşturamadığı ayrcı sabit sıvı ortamında, ana suş gibi tüm alana dağılarak homojen büyüme yerine, minimal bir besi yeri olan MSgg besi yerinde tabanda kitleler oluşturarak toplu toplu büyüyebildiği gözlenmiştir. Bu durum basilisin yokluğunun herhangi bir okzotrofiye neden olabileceği olasılığını akla getirmekle birlikte, Basilisin üretemeyen Bac- B. subtilis NCBI 3610 suşunun denenen kompleks, minimal ve sıvı biyofilm oluşturma besi yerinde çalkalamalı ortamda rahatlıkla büyüdüğü, ana suş ile aynı büyüme hızını gösterdiği, herhangi bir okzotrofik bozukluğunun bulunmadığı anlaşılmıştır. Tüm bu sonuçlar basilisinin ilgili üretici suşta, kemotaksis, kayma harketlilik ve biyofilm oluşum mekanizmalarını pozitif yönde kontrol edilmesini sağlayan bir sinyal molekülü olduğuna işaret etmektedir. Bu çalışmada aynı zamanda, biyofilm oluşturma katı ve sıvı besi yerinde glikoz, galaktoz ve ksiloz gibi faklı karbon kaynaklarının, basilisin üretemeyen mutant ve ana B. subtilis NCBI 3610 suşlarında, biyofilm oluşumunu nasıl etkilediğide incelenmiştir. Glikozun ana suşda sıvı ve katı besi yerinde hem büyümeyi hemde biyofilm oluşumunu desteklediği gözlenirken, ksilozda katı besi yerinde oluşturulan koloni büyüklüğünün glikoza göre belirgin şekilde küçüldüğü fakat kompleks koloni morfolojisinin yada diğer deyişle biyofilm oluşumunun gerçekleştiği görülmüştür, ayrıca sıvı besi yerinde glikoza kıyasla daha az yüzey büyümesi gözüksede 72. saat sonunda belirgin bir yüzey biyofilmi oluştuğu görülmüştür. Galaktoz içeren sıvı besi yerinde, glikoza ve ksiloza göre daha az bir yüzey büyümesi oluşmuş fakat ksiloz gibi 72. saat sonunda gene belirgin bir yüzey büyümesi oluşturulurken, galaktoz içeren katı besi yerinde, büyümenin bir hayli kısıtlandığı, biyofilm oluşumu olmadığına işaret eden, küçük pürüzsüz bir koloni oluşumu gözlenmiştir. Basilisin üretemeyen mutant suşda ise glikoz, ksiloz ve galaktoz içeren sıvı besi yerinde belirgin bir büyüme gözlenmezken, glikoz, ksiloz ve galaktoz içeren katı besi yerlerinde bir hayli küçük pürüzsüz koloni oluşturabildiği gözlenmiştir. Özellikle mutant suşda açığa çıkan bu büyüme kısıtlaması mutant suşun oksijen çözünürlüğünün kısıtlı bulunduğu sabit ortamda glikoz, ksiloz ve galaktozu kullanmada sorun yaşadığı olasılığına işaret etmektedir. Nitekim, glikoz, ksiloz ve galaktoz içeren aynı besi yerine ekilen fakat çalkalanmıs ortamda büyütülen mutant suşun, glikoz ve ksiloz içeren sıvı besi yerinde rahatlıkla büyüdüğü ve hatta ana suşla aynı spesifik büyüme hızına sahip olduğu ve durağan faza ana suşa kıyasla daha geç girdiği gözlemlenmiştir. Diğer taraftan, galaktoz içeren çalkalamalı ortamda, spesifik büyüme hızının ana suşa göre biraz daha yavaşladığı ve durağan faza daha erken girdiği gözlenmiştir. Kompleks bir besi yeri olan Luria sıvı besi yerinde B. subtilis NCBI 3610 suşunun biyofilm oluşturamadığı bilinmektedir. Bu çalışmada son olarak, böyle bir ortamda basilisinin sinyal molekülü gibi davranıp biyofilm oluşumunu tetikleyebilme olasılığı da araştırılmıştır. Bu amaçla basilisin üretici suş B. subtilis PY79 basilisin üretim besi yeri PA sıvı besi yerinde 16 saat büyütülerek kültür sıvısından basilisin konsantresi hazırlanmış, artan konsantrasyonlarda, sabit LB besi yerine eklenerek, ekilen B. subtilis NCBI 3610 kültürlerinin yüzey büyümeleri üç gün boyunca izlenmiştir. Basilisinin tam anlamı ile biyofilm oluşumunu tetiklemesede, biyofilm oluşumunun ilk basamağı sayılan yüzey büyümesini belirgin bir şekilde tetiklediği gösterilmiştir.

Unlike laboratory strains such as Bacillus subtilis PY79 that is not able to perform swarming motility and biofilm formation, B. subtilis NCBI 3610 is a well-known undomesticated wild type strain for its ability to form robust biofilms called as pellicles at non-agitated liquid and solid surfaces. The formation of biofilm matrix can be induced as a response to external signals such as lipopeptide antibiotic surfactin in B. subtilis. Initially, biofilm cells are motile and while the maturation of biofilm proceeds, cells become sessile (non-motile) adherent to each other. The biofilm matrix has a polymeric structure that is encoded by epsA-O operon and it is mainly composed of polyssacharides. Additionally, proteins, lipids and other biopolymers are present inside the matrix. Although most of the factors that are crusial for the formation of biofilm are revealed, signals required for the initiation of mutlicellularity is still mysterious. It is known that antibiotics not only act as an antimicrobial agent but it may also act as a signaling molecule by regulating the expression of specific genes as a response to environmental changes. Although it was shown that some antimicrobial agents such as subtilisin can act as a signaling molecule by recognizing cell density, the effects of many others remain still unknown. Bacilysin is a dipeptide antibiotic, synthesizd by Bacillus subtilis, composed of L-alanine and non-ribosomally synthesized L-anticapsin aminoacid that is active against wide-range of bacteria and some fungi. It was recently investigated that the biosynthesis of bacilysin depends on polycistronic operon ywfBCDEFG (renamed as bacABCDEF) and an adjacent monocistronic gene ywfH. Bacilysin biosynthesis is under the control of a quorum sensing regulation system through the action of ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ ComA and in a Spo0K (Opp)-dependent manner in B. subtilis. Furthermore, it can be positively regulated by global regulatory factor Spo0A and negatively regulated by transition state regulators CodY and AbrB. In addition, bacilysin biosynthesis is under synergistic regulation of guanosine 5’-diphosphate 3’-diphosphate (ppGpp). Despite having known the synthesis mechanism and regulation of bacilysin biosynthesis quite well, much less is known about the role of bacilysin in the host organism. The present study mainly focused on the effects of bacilysin on B. subtilis wild type 3610 strain by analyzing the expression level of several regulatory genes related to extracellular matrix component of biofilm, chemotaxis, swarming motility on bacilysin deficient bac- 3610 mutant strain under biofilm forming condition. For this purpose, both wild type and its bacilysin deficient derivative were grown under MSgg agar medium in order to promote biofilm formation, cells were collected and RNAs were extracted at 24th, 48th and 72nd growth phases to determine the change in expression levels of several genes. Relative gene expression analysis was conducted by using reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR). For the relative quantification, 2-Cp method was used and then log2 transformed. Our results from the RT-qPCR analysis indicates that in the absence of bacilysin, expression of many genes related to chemotaxis, motility, extracellular alkaline protease synthesis and biofilm formation were significantly down regulated. These data were further supported by swarming motility and biofilm (pellicle and colony architecture) assays. bac- 3610 strain was unable to exhibit swarming motility and was unable to form biofilm under non-agitated standing culture biofilm promoting MSgg medium. Consistently, when compared with undomesticated 3610 strain that is able to form complex colony architecture, mutant strain forms fragile flat surface growth in the solid MSgg agar medium suggesting that bacilysin disruption impaired biofilm formation. These results were compatible with obtained RT-qPCR data where most of the genes related to swarming and extracellular matrix component were shown to be up-regulated by bacilysin in most of the growth phases. Briefly, this study revealed that, bacABCDEF operon is responsible for the regulation of many adaptive responses of B. subtilis including biofilm formation, chemotaxis, swarming motility, competence development and stress response. Moreover, bacilysin, as a signaling molecule, might be involved in the induction of surface growth that is preliminary step of biofilm formation.