Helıcobacter Pylorı Enfeksiyonlarının Doğru Klinik Tanısı İçin Virülans Faktörleri İle T Hücreye Bağımlı Bağışıklığın Çoklu-pzt İle Taranması Ve Biyoinformatik Modellemesi

Abstract

Helicobacter pylori dünya nüfusunun yarısından fazlasında, yaşamlarının bir döneminde görülen kronik mide enfeksiyonlarına yol açan bir bakteridir. H. pylori gram negatif, mikroaerofilik, spiral şeklinde bir bakteridir ve yaklaşık olarak 3 mikrometre uzunluğunda olup, 0.5 mikrometre çapında 2 ile 6 mikrometre arasında değişen hareket etmesine yardımcı olan kamçılara sahiptir. Çocukluk çağında kazanılan H. pylori enfeksiyonu ömür boyu sürmektedir. H. pylori ile enfekte olan bireylerin büyük çoğunluğu hastalık belirtisi göstermezken, bakterinin enfekte ettiği kişilerin % 20’sinde kronik gastrit, peptik ülser, mukoza ile ilişkili lenfoid doku lenfoması (MALT) ve mide adenokarsinomunda etiyolojik etken olduğu yönünde önemli bulgular vardır. Bakterinin prevalansı, gelişmekte olan ülkelerde gelişmiş ülkere kıyas ile daha yüksektir. Ülkemizde ise erişkin toplumun yaklaşık % 70-80 kadarında bulunur. Bakterinin tam olarak bulaş yolu bilinmemekle beraber fekal-oral ya da oral-oral yollar ile bulaş olabildiği düşünülmektedir. H. pylori enfeksiyonunun tanısı genellikle dispeptik belirtilerin varlığı ve H. pylori enfeksiyonunu gösteren invaziv ve invaziv olmayan bazı testler yapılması sonucunda konur. Enfeksiyon tedavisi için kullanılan standart H. pylori antibiyotikleri ile proton pompası inhibitörlerinin yanı sıra son yıllarda hızla gelişen ilaç direnci H. pylori enfeksiyonunun tedavisi için farklı ilaç kombinasyonlarının uygulanmasını gerektirmiştir. H. pylori enfeksiyonu sonucu oluşabilecek klinik tablolar bakterinin virülans faktörleri, konağın genetik faktörleri ve bağışıklık yanıtı ile yakın ilişki içerisindedir. H. pylori’nin virülans faktörleri bakterinin neden olduğu yangıya, doğal bağışıklık hücrelerini uyarmak, epitel hücrelerindeki doku homeostazisini korumak ya da konağın sinyal yolakları etkilemek gibi farklı mekanizmalar yardımı ile yol açmaktadır. cagA (sitotoksinle ilişkili A geni), vacA (vaküol oluşturucu sitotoksin geni), babA (epitel hücrelerde fukosillenmiş Lewis B antijenlerine bağlanan adezin proteinini kodlayan gen), oipA (dış zar enflamatuar A proteinini kodlayan gen), hpaA (hücreye bağlanmayı güçlendiren, hücre saldırısını kontrol eden adezin genleri), ure A ve ureB (üreaz enzimini kodlayan genler), dupA (duodenal ülser yönlendirici gen), napA (nötrofil aktive edici gen) H. pylori’nin mide mukozasına tutunmasında, kolonize olmasında ve mide de enfeksiyona neden olmasında etkili olan en önemli virülans faktörleridir. H. pylori’nin virülans faktörlerinin yanı sıra konağın H. pylori enfeksiyonuna karşı oluşturduğu bağışıklık yanıtı da enfeksiyonun doğuracağı klinik tablolar açısından oldukça önemlidir. T hücreleri, hücresel bağışıklık yanıtının parçası olup H. pylori enfeksiyonundan korunmada önemli göreve sahiptirler. Gelişimleri timusta gerçekleşir ve sonrasında periferdeki sekonder lenfoid organlara göç ederler. T hücreleri, CD8+ sitotoksik T hücreleri, CD4+ yardımcı T hücreleri ve düzenleyici T hücreleri (CD4+CD25+ Treg) olmak üzere üç gruba ayrılmaktadır. Yardımcı T hücreleri konağın gösterdiği bağışıklık yanıtında aracı hücrelerdir. Yardımcı T hücreleri T yardımcı 1 (Th1), T yardımcı 2 (Th2) ve T yardımcı 17 (Th17), T yardımcı 9 (Th9) ve T yardımcı 22 (Th22) olarak adlandırılan beş ayrı yardımcı T hücrelerine farklılaşmaktadır. Th1 hücreleri kaynaklı bağışıklık yanıtı hücre içi patojenlere karşı korumada rol almaktadır. Th2 hücreleri, hücre dışı parazitlere karşı oluşturulacak bağışıklık yanıtında görevlidir. Th1 ve Th2 hücrelerinden farklı olan ve yakın zaman önce tanımlanan Th17 hücreleri ise hücre dışı mikroorganizmalara karşı konak savunma mekanizmalarından sorumludur. Th9 hücrelerinin patolojik rolü çok açık olmamakla birlikte, pro-inflamatuar Th17 hücrelerinin yol açmış olduğu bağışıklık yanıtını arttırdığı ve T hücre toleransını aracı olarak kullanarak allograft reddini önleyebildiği gösterilmiştir. Th22 hücreleri mikrobiyal patojenlere karşı savunmada, doku onarımı ve doku yenilenmesinde rol almaktadır. Düzenleyici T hücrelerinin (Treg) temel görevi ise bağışıklık yanıtının kontrol altında tutulmasını sağlamaktır. Otoimmün yanıtların oluşmasının engellenmesinde ve enfeksiyon sonrasında patojen mikroorganizma temizliğinde de görev almaktadır. CD4+ T hücrelerinin polarize yanıtları, salgıladıkları sitokin profillerine göre farklılık göstermektedir. Daha önce yapılan bilimsel çalışmalarda T hücreleri ile Helikobakter pilori enfeksiyonu arasındaki ilişki açıkça ortaya konmuştur ve belirtilen T hücre yanıtlarının H. pylori’nin farklı suşlarının içerdiği virülans faktörlerine göre farklılık gösterebileceği öne sürülmüştür. Konağın vücut bağışıklık yanıtına bağlı olarak, Th1 ve Th17 yardımcı hücrelerini kapsayan CD4+ T hücreleri H. pylori ile enfekte olan hastalarda enflamatuvar yanıtta yer almaktadır ve CD4+CD25+ düzenleyici T hücrelerinin miktarı H. pylori ile enfekte olan hastaların mide mukozasında ve periferik kanınında yüksek oranda bulunmaktadır. Fakat H. pylori enfeksiyonunda önemli rolü olan 9 virülans faktörünün; CagA, VacA, OipA, BabA, HpaA, NapA, DupA, UreA, UreB H. pylori ile enfekte olan hastarda görülen T hücre yanıtı ile (Th1, Th17 ve Treg) arasındaki ilişkileri tam olarak bilinmemektedir. Gerçekleştirdiğimiz çalışmamızda, H. pylori enfeksiyonunda önemli olduğu düşünülen dokuz virülans faktörü için geliştirilecek olan çoklu-PZT’nin sonuçları ile H. pylori ile enfekte gastritli ve ülserli hastalarda gelişen T hücre yanıtlarının, Th1, Th17ve Treg, arasındaki ilişkinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya 1 yıl boyunca Acıbadem Hastaneleri Gastroenteroloji Servisi’ne dispepsi yakınmasıyla başvuran ve Endoskopi bölümünde gastroduodenoskopi uygulanan - 18-65 yaş arası, çalışma kriterlerine uygun 18 ülserli, 62 gastritli toplam 80 erişkin hasta dahil edilmiştir. Negatif kontrol olarak ise18 reaktif gastropati tanısı konulan hasta kullanılmıştırdı. Endoskopi yapılan hastalardan antrum küçük kurvaturdan 2 adet, korpus büyük kurvaturdan 2 adet olmak üzere toplamda 4 adet biyopsi örneği alınmıştır. Alınan biyopsi örneklerinin birinden DNA, diğerinden ise RNA izolasyonu yapılmıştır. İzole edilen DNA örnekleri dokuz farklı virülans genini bir arada saptayabilmek için geliştirilmek istenen çoklu-PZT çalışmaları için kullanılmıştır. RNA örnekleri ise T hücre alt gruplarının belirteçleri olan transkripsiyon faktörleri ve sitokinlerin RNA düzeyinde ekspresyonlarının incelenmesi için kullanılmıştır. Virülans faktörleri ve Th1, Th17 ve Treg hücrelerine ait sitokinler ve transkripsiyon faktörlerini belirleyebilmek için primerler tasarlanmıştır. Çalışmaya virülans faktörlerini bir arada saptayabilmek için geliştirilmek istenen çoklu-PZT ile başlanılmış, H. pylori’ye ait olan tüm virülans faktörlerini taşıdığı bilinen G27 suşu pozitif kontrol olarak kullanılarak çoklu PZT için tepkime denemeleri ve optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca sadece ureA ve ureB genlerini tek bir PZT ile saptayabilen bir yöntemde geliştirilmiştir. T hücre alt gruplarının belirteçleri olan transkripsiyon faktörleri ve sitokinler için konvansiyonel PZT ile izlenebilir PZT’de standart eğriyi belirleyebilmek için pozitif hasta grupları bulunmuş ve optimizasyon çalışmaları tamamlanmıştır. Optimize edilmiş izlenebilir PZT ile içerisinde 62 gastritli ve 18 ülserli hasta grubunun bulunduğu 80 hasta için Th1, Th17 ve Treg hücrelerinin gruplarının belirteçleri olan transkripsiyon faktörleri (RORɣT, FOXP3) ve sitokinlerin (IFNɣ, IL-17) RNA düzeyinde ekspresyonları izlenebilir PZT ile incelenmiştir. Çoklu-PZT optimizasyon çalışmaları sonucunda 9 farklı virülans genini üç farklı PZT karışımı ile saptamak olanaklı hale gelmiştir. ureA, ureB, cag A, hpaA, napA genlerinin bir karışımda, oipA, dupA, vacA genlerini bir karışımda ve babA genini bir karışımda saptamak olanaklı olmuştur. Çalışma sırasında geliştirilen yalnızca ureA ve ureB genini içeren çoklu bir PZT tepkimesi ile çalışma grubundaki hastalara üreaz taraması yapılmıştır. Geliştirilen çoklu üreaz PZT sonuçları ile hasta örneklerine uygulanan hızlı üreaz testi ve patolojik değerlendirme sonuçları arasında karşılaştırma çalışması yapılmıştır. Karşılaştırma çalışmaları sonuçlarına göre çoklu üreaz PZT ve patolojik değerlendirme yöntemlerinin hızlı üreaz test yöntemine göre daha benzer ve duyarlı sonuçlar verdiği belirlenmiştir. Çoklu-PZT sonuçları ve gerçek zamanlı-PZT sonuçları biyoinformatik çalışmalar ile bir araya getirilerek H. pylori enfeksiyonu sonucunda oluşabilecek gastrit ya da ülseri birbirinden ayırabilecek faktörleri birarada gösteren bilgisayar tabanlı modeller oluşturulmuştur. Çoklu-PZT sonuçlarına göre test edilen bütün virülans faktörleri içerisinde napA geni ülserli hastalarda gastritli hastalara göre daha yüksek oranda pozitif bulunmuştur. Ülserli ve gastritli hastalarda DupA virülans faktörü ile IFN-γ arasında, babA virülans faktörü ile IL-17 arasında pozitif ilişki bulunmuştur. Bilgisayar tabanlı modelleri doğrultusunda hastalardan izole edilen H. pylori’nin vacA m1/m2, ureA ve cagA gen durumlarının, enfekte olan hastaların IFN-γ (Th1), IL-17 (Th17) ve FOXP3 (Treg) ekspresyon seviyelerinin bilinmesi ile enfeksiyonun doğuracağı klinik sonuçları önceden tahmin etmek olanaklı hale gelmiştir. Yapılan bu çalışmada H. pylori’ ye ait olan 9 virülans faktörü ile Th1, Th17 ve Treg hücre yanıtları arasındaki ilişki gastritli ve ülserli hastalarda açıkça ortaya konmuştur. Bu çalışma ile literatürde bilindiği üzere ilk defa H. pylori ile enfekte olan hastalardan izole edilen bakteri izolatlarının sahip olduğu virülans faktörleri ile hastaların bağışıklık yanıtı ilişkilendirilerek bilgisayar bazlı modeller kullanarak klinik sonuçlarını önceden tahmin etmek olanaklı hale gelmiştir.

Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram-negative, microaerophilic, spiral-shaped bacterium that colonizes the stomach of more than half of the world’s population during their life span. The bacteria appear around 3μm in length and possess a unipolar bundle of two to six sheathed flagella, about 0,5μm in size, that enable the bacteria to move in the acidic environment of stomach. H. pylori infection is usually acquired in early childhood and persists throughout the life. While most infected individuals remain asymptomatic, H. pylori infection can cause peptic ulcer, chronic gastritis, mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphomas and gastric cancer in 20% of the infected ones. The prevalence of H. pylori is higher in developing countries and it may reach 70-80% of adults in Turkish population. While the exact route of transmission is unknown, acquisition may occur through fecal to oral or oral to oral contact. H. pylori infection can be diagnosed by the presence of dispeptic symptoms. Invasive and non-invasive methods are also used for the diagnosis of the H. pylori infection. Combination of antimicrobial agents and proton pump inhibitors has been used for the treatment of H. pylori infection; however, drug resistance may cause treatment failures, for which different drug combinations are used to overcome this problem. The outcome of H. pylori infection is closely related with bacteria's virulence factors, host genetic factors and host immune response. Bacterial virulence factors contribute to the inflammatory response towards H. pylori either by different mechanisms like host-signaling pathways, maintaining tissue homeostasis in epithelial cells or by stimulating the innate immune cells. Cytotoxin-associated gene A (cagA), vacuolating cytotoxin gene A (vacA), outer inflammatory protein A (OipA), blood group antigen-binding adhesion (BabA), putative neuraminyllactose-binding hemaggluttinin homolog A (HpaA), neutrophil activating protein A (NapA), duodenal ulcer promoting gene A (dupA), urease subunit A (UreA), urease subunit B (UreB) are the most important H. pylori virulence factors that play a role in the bacterial adhesion, colonization and infection. Besides the virulence factors, type of the immune response of the host against H. pylori is crucial for the outcome of the infection. T cells are types of lymphocytes that play a central role in cell-mediated immunity against H. pylori infection. T cells develop in the thymus, and then enter the circulatory system. T cells are classified as cytotoxic T cells (CD8+ T cell), helper T cells (CD4+ T cell) and regulatory T cells (CD4+CD25+ T cell). Helper T cells differentiate into five major subsets known as T helper 1 (Th1), T helper 2 (Th2), T helper 17 (Th17), T helper 9 (Th9) and T helper 22 (Th22). T helper 1-based immune responses are required for protection against intracellular pathogens. T helper 2 cells are responsible for the protection against extracellular parasites. Recently described T helper 17 (Th17) cells are responsible for mediating defensive mechanisms of the host against various infections including extracellular bacteria and fungi infections. In previous studies, the association between T cells and H. pylori infection has already been identified. Th1 and Th17 cells are involved in response to H. pylori infection and contribute to the development of H. pylori – related pathology. Moreover, colonization with H. pylori leads to the expansion of regulatory T cells (Tregs) which limits the inflammatory response and cause the establishment of chronic infection. Th1, Th17, and regulatory T-cells (Treg) are localized in both gastric mucosa and peripheral blood of H. pylori – infected patients. It is anticipated that there may be a close relationship between the H. pylori infection and bacterial virulence factors for the clinical outcomes of the infection. However, the effects of nine major Helicobacter pylori specific virulence factors; CagA, VacA, OipA, BabA, HpaA, NapA, DupA, UreA, UreB on Th1, Th17 and Treg cell response in H. pylori - infected patients with gastritis and ulcer have not been fully elucidated. Therefore in this study, we aimed to investigate the association between the nine major (CagA, VacA, OipA, BabA, HpaA, NapA, DupA, UreA, UreB) Helicobacter pylori specific virulence factors with three various T cell subsets (Th1, Th17 and Treg) at mRNA expression levels in H. pylori-infected gastritis and ulcer patients. The presence/absence of nine virulence factors were detected using multiplex-PCR and mRNA expression levels of T cell specific factors were determined using quantitative real time-PCR. In total of 80 adult patients, 18 with ulcer and 62 with gastritis were included in this study. In addition, 18 patients with reactive gastropathy were included as the negative control group. These patients were admitted to Acibadem hospitals with gastrointestinal symptoms and underwent endoscopy. During endoscopy, two gastric antral and corpus biopsies were taken from each patient. One antral and one corpus samples were used for DNA isolation and the other antral and corpus samples were used for RNA isolation. Isolated DNA samples were used to develop a multiplex-PCR assay to detect nine H. pylori-specific virulence factor genes. Moreover, RNA samples were used to detect expression levels of Th1, Th17 and Treg cells - specific cytokines and transcription factors using quantitative real- time PCR (RT-PCR) assays. Primers were designed using primer design software for the H. pylori – specific virulence genes, Th1, Th17 and Treg cell – specific cytokines and transcription factors. First step of the study was the development of multiplex-PCR to detect virulence factor genes. Optimization of multiplex-PCR assay was done by using H. pylori G27 strain that includes all the virulence genes. Also, a multiplex urease PCR assay was developed to detect ureA and ureB genes in a single PCR assay. In the second step, positive samples were detected by the conventional PCR for each cytokine and transcription factor. These positive samples were used to set up the standard curve in the quantitative real time-PCR for each cytokine and transcription factor. Detection of the nine virulence genes using a multiplex-PCR assay within a three polymerase chain reaction was achieved; ureA, ureB, cag A, hpaA, napA in a one reaction, oipA, dupA, vacA in another reaction and babA in a third reaction. All DNA isolated from biopsy samples were tested with the developed multiplex urease PCR assay. A comparison study was performed between the results of the multiplex urease PCR assay, rapid urease test and pathological evaluation that were applied to patient samples. According to the results, it was determined that multiplex urease PCR and pathological evaluation methods produced more similar and precise results than the rapid urease test method. Within all virulence factors that were tested, only the prevalence of NapA virulence factor was significantly higher in patients with ulcer than gastritis. Additionally, a positive correlation between the H. pylori DupA virulence factor and IFN-γ, and H. pylori BabA virulence factor and IL-17 was detected in gastritis and ulcer patients, respectively. By using computer-based models, clinical outcomes of patients infected with H. pylori can be predicted by screening the patient's H.pylori vacA m1/m2, ureA and cagA status and IFN-γ (Th1), IL-17 (Th17), and FOXP3 (Treg) mRNA expression levels. Herein, for the first time, the relationship between H. pylori virulence factors and host immune responses for diagnostic prediction of gastric diseases using computer-based models were reported. Furthermore, a novel expert - derived model has been developed to identify the set of factors and rules that may distinguish the ulcer patients from gastritis patients.