His226 Mutasyonunun Dnak Atpaz Domeni Üzerindeki Dinamiklerinin, Moleküler Dinamik Simulasyonları İle Analizi

Abstract

Proteinler, canlılar için yaşamsal açıdan önemli makromoleküllerdir. Sentezlendikten sonra fonksiyonel özelliklerini kazanmaları içinse doğru şekilde katlanmaları şarttır. Peptid zinciri sentezlenirken, üç boyutlu yapısını kazanması sürecinde görülen ilk etkileşimler hidrofobik etkileşimlerdir. Sonrasında ise iyonik etkileşimler,van der Waals etkileşimleri, dipol-dipol etkileşimleri, hidrojen bağları ile birlikte peptit zincirleri fonksiyonel hale geldiği üç boyutlu yapısına ulaşır. Bazı küçük proteinler bu şekilde tek başına katlanabilirken, pek çok protein katlanabilmek için şaperonlara ihtiyaç duyar. Proteinlerin düzgün katlanamaması ise, Alzheimer, Parkinson gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklara sebebiyet verebilir. Şaperonlar ilk kez 1978 yılında Ron Laskey tarafından bulundu. 1987 yılında R. John Ellis tarafından yapılan çalışmalarla birlikte, bu konudaki araştırmalar hız kazandı. Eksikliklerinde nörodejeneratif hastalıkların oluştuğunun keşfedilmesi ile beraber, şaperonlar ile ilgili çalışmalar oldukça sık gündeme gelmeye başlamıştır. Şaperonlar, normal şartlarda hücrede normal seviyelerde sentezlenir. Stres koşulları ise bu durumu değiştirebilir. Şaperonlar hücrenin aşırı ısı ve pH değişiminden olumsuz etkilenmemesini sağlamanın yanında oksidatif stres ve kimyasal stres gibi durumlara karşı da hücreyi korur. Bu gibi streslere karşı hücrenin bir savunma stratejisi olarak, şaperonların ekspresyonları artar ve tehdit altında olan hücre içi yaşamsal öneme sahip enzimlerin ve diğer proteinlerin yapısının bozularak fonksiyonel olarak zarar görmeleri engellenir. Hsp70, şaperon ailesinin en bilinen ve en yaygın üyesidir. Şaperonlar evrimsel süreçte korunmuş moleküler şaperonlar arasında yer almaktadır. Bakteri, arkea ve ökaryotlarda olmak üzere neredeyse tüm hücrelerde bulunurlar ve hayati açıdan önemli rollere sahiptirler. Örneğin, yeni eksprese edilmiş peptit zincirlerinin katlanması, agregat oluşumunun önlenmesi ya da proteinlerin belirli organellere translokasyonu Hsp70 tarafından gerçekleştirilir. Hsp70, katlanacak proteinin hidrofobik bölgelerine bağlanarak bu bölgelerin birbirleriyle doğru olmayan şekilde etkileşmesini önler, bu sayede proteinin yanlış katlanmasını engeller. Bu sebepten ötürü, Hsp70'in proteinlerin katlanmasında katalizör görevi görmediği, katlanması gereken proteinler için uygun ortam oluşturduğu düşünülmektedir. Çalışmamızda kullanılan E.coli Hsp70 homoloğu olan DnaK iki domenden oluşmaktadır. Bunlardan biri amino (N) ucunda bulunan nükleotit bağlayan ve ATPaz aktivitesi olan 44 kDa'lık Nükleotit Bağlanan Domen (NBD), diğeri ise karboksil (C) ucunda bulunan ve substrat bağlayan 25 kDa'lık Subsrat Bağlanan Domen (SBD)'dir. Bu iki domen ise oldukça korunmuş, domenler arasında bulunan xxiv hidrofobik bir bağlaç ile bağlanır. NBD ve SBD arasında allosterik bir etkileşim mevcuttur. Bu iki domen arasındaki iletişim ise domenler arasındaki bağlaç tarafından sağlanmaktadır. Her iki domende de gerçekleşen konformasyonel değişiklikler sonucunda, ATP bağlanması ve hidrolizi substrat affinitesini düzenlerken, ATP hidrolizi ise substrat bağlanması ile tetiklenmektedir. Yapılan kristalografi ve NMR çalışmaları sonucunda elde edilen yapılarda, ADP bağlı halde, bu iki domen ve bağlaç birbirinden ayrı şekilde gözlemlenmektedir. Bu durumda SBD'nin substrata olan afinitesi yüksektir ve dolayısıyla SBD, katlanacak protein üzerine kapanmış durumdadır. NBD'ye ATP bağlandığında ise, SBD açık bir konformasyonda ve bağlacı NBD'nin içlerine alacak şekilde NBD ile etkileşmektedir. Bu konformasyonda SBD'nin substrata afinitesi düşüktür ve katlanmış proteinin salınması ATP bağlı halde gerçekleştirilir. Sonrasında, SBD'ye bağlanan katlanması gerekli yeni bir protein, NBD'ye bağlı halde bululanan ATP'nin hidrolizini tetikler. ATP'nin ADP'ye hidrolizi sırasında SBD katlanması gereken proteinin üzerine kapanır, NBD ve SBD birbirinden tekrar ayrılır ve mekanizma bu döngü ile devam eder. Bu döngüye koşaperonlar eşlik eder. Hsp40 ailesi ve nükleotit değişim ailesi bu döngüde görevli koşaperonlar olarak bilinir. Hsp40 ailesi (DnaK için DnaJ), ATP hidrolizini hızlandırmakla görevliyken, nükleotit değişim faktörleri (DnaK için GrpE) ise hidroliz ile oluşan nükleotiti değiştirmek ve Hsp70'yi yeni döngüye hazırlama görevindedir. Mayer ve Bukau'nun 2015 yılında yaptığı son çalışmalar, ATP ile indüklenen substrat salınımının, substratın bağlanmasıyla uyarılan ATP hidrolizine göre şaperonun aktivitesinde daha önemli bir rol oynadığını ortaya koymaktadır. 2007 yılında, Swain grubu tarafından yapılan çalışmalarla, domenler arası bağlacın hidrofobik 389VLLL 392 sekansının NBD ve SBD arasındaki allosterik ilişkiden sorumlu olduğu bulunmuştur. Yine bu çalışmaya göre, bağlaç varlığında DnaK (1- 392), substrat tarafından uyarılmış yabanıl tip DnaK gibi davranmaktadır. Yabanıl tip, substrat ile uyarılmamış DnaK'nin aksine, DnaK (1-392)'nin pH bağımlı ve daha yüksek ATPase aktivitesi vardır. Diğer bir taraftan ise, bağlaç yokluğunda DnaK (1- 388), substrat tarafından uyarılmamış yabanıl tip DnaK'yi taklit etmektedir. Moleküler dinamik simulasyonları, 1950 yıllarının ikinci yarısına doğru ortaya çıkmıştır. 1960'larda daha da gelişmiş ve ilk kez 1977 yılında bovin pankreatik tripsin inibitörü ile birlikte proteinler üzerinde kullanılmaya başlanmıştır. In vivo ve in vitro olarak gözlemlemekte güç olabilecek bazı konularda fikir vermek için kullanılan önemli yollardan biri haline gelmiştir. Biyokimya ve biyofizikte oldukça geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Bu çalışma DnaK (1-392) ve (1-388) kesik yapılarında, ATP bağlı durumda konformasyonel ve dinamiksel farklılıkları göstermeyi amaçlamanın yanısıra 226. konumdaki histidinin alanine mutasyonu halinde genel konformasyon ise de nasıl bir değişim olduğunu moleküler dinamik analizleriyle göstermeyi amaçlamaktadır. Kesik yapılar 4JN4 kodlu PDB (protein data bank) dosyasından modifiye edilip, NAMD/CHARMM-GUİ kullanılarak 200 ns boyunca yürütülmüştür. Bu süreçte ortalama karekökten sapma (RMSD) ve ortalama karekök değişimi (RMSF) gibi temel moleküler dinamik analizlerinin yanısıra, Başlıca Komponent Analizi (PCA), hedef amino asitler için zamana bağımlı uzaklık ölçümleri ve proteinin ne kadar kompakt olduğunu ölçmek amacıyla dönüş çapı (Rg) analizi yapılmıştır. Yapılan analizler sonucu bağlacın 389VLLL392 kısmının bulunmadığı DnaK (1-388) kesik yapısının, bağlacın bulunduğu DnaK (1-392) yapısına gore belirli bölgelerde xxv daha kapalı bir konformasyonda olduğu gözlemlenmiştir. Ayrıca bu iki yapı arasında farklı dinamikler olduğu da görülmektedir. Bir diğer önemli sonuç ise bağlaç varlığında His226'nın bu dinamikte önemli bir rolü olduğu yönündedir. 226 numaralı Histidinin alanine mutasyonu ile birlikte, konformasyonun daha da açıldığı, bazı amino asitlerin de bulunduğu konumdan oldukça saptığı görülmüştür. Bunlardan önemli olarak gördüğümüz katalitik bölgede bulunan ve ATP hidrolizinden sonra fosfatı kabul eden amino asit olduğu düşünülen 199. konumdaki Treonin yakından incelendiğinde simulasyon sürecinin sonlarına doğru ATP'den aniden ve önemli ölçüde uzaklaştığı görülmüştür. Bu durumun doğurabileceği sonuçlar, araştırma grubumuza ait diğer deneysel verileri desteklemekle birlikte Histidinin Hsp70 genel dinamiği için ne kadar önemli olduğunu da göstermektedir. Uzun vadede, yapılan bu moleküler dinamik simulasyon çalışmalarının Hsp70 çalışma mekanizmasını detaylı bir şekilde ortaya koyarak Hsp70 kaynaklı nörodejenaratif hastalıkların tedavisine ışık tutabileceği düşünülmektedir.

Hsp70s are evolutionarily highly conserved ATP-dependent molecular chaperones which are ubiquitously expressed in the cell. They are found in three domains of life and have essential roles in cells, such as aiding proper folding of nascent polypeptides, prevention of polypeptide chains from misfolding and translocation of proteins across membranes. The diverse cellular functions of Hsp70s are based on the recognition of hydrophobic sequences of client protein. Hsp70s corporate with other co-chaperones like nucleotide exchange factors and J-domain proteins. In our study, we used DnaK which is an Escherichia coli homolog of Hsp70. DnaK have an N-terminal nucleotide-binding ATPase domain (NBD) and a C-terminal substrate-binding domain (SBD). These two domains are connected by a highly conserved hydrophobic interdomain linker. There is an allosteric communication between the domains via the hydrophobic linker. Substrate affinity is regulated by ATP binding and hydrolysis, which results in conformational changes in both domains, while ATP hydrolysis is stimulated by substrate binding. In 2007, Swain et al. revealed that the conserved hydrophobic 389VLLL392 sequence of the interdomain linker is responsible for the allosteric communication between NBD and SBD. According to this study, DnaK (1-392) behaves like the substrate-stimulated DnaK that is pH-dependent, and shows higher activity than that of the unstimulated fulllength protein. In contrast, DnaK (1-388) mimics the activity of the substrate-free form of the full-length DnaK. Which amino acids in the catalytic site are responsible in allosteric communication and pH-dependent ATPase activity in the presence of linker are not enlightened so far, however there are several research trying to find out the key residues and reveal the detailed mechanism of DnaK. In this study, the effect of linker 389VLLL392 on the ATP-bound protein conformation and H226A mutation on ATP-bound DnaK's (1-392) construct were investigated by using molecular dynamics simulations. MD simulation trajectories were analyzed by root mean square deviation (RMSD) and, root mean square fluctuation (RMSF) analysis, also by distance measurement in a time-dependent manner and, principle component analysis. From these analysis it was found that distance between the helices which contain His226 and its neighbour helix is closer to each other in DnaK (1-388) constructs. Moreover, this study reveals that His226 contributes the stabilization of residue Thr199 which is suspicious as a phosphate acceptor after the hydrolysis of ATP.