Hyalüronik Asit’in Çözeltideki Konformasyonunun Proton Hareketliliğine Etkisi

thumbnail.default.placeholder
Tarih
2016 -11-28
Yazarlar
Mihlaç, Gökçe
Süreli Yayın başlığı
Süreli Yayın ISSN
Cilt Başlığı
Yayınevi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Institute of Science and Technology
Özet
Hyaluronik asit (HA) tekrarlayan D-glukuronik asit ve N-asetilglukozamin disakkarit birimlerinden oluşan bir biyopolimerdir. Çeşitli kaynaklardan elde edilen HA’ların molekül ağırlığı 104 ve 107 dalton arasında değişmektedir. Fizyolojik koşullarda sodyum tuzu biçiminde bulunur ve bundan dolayı polimer zincir üzerinde negatif yük taşır, polielektrolit karakter gösterir. Omurgalı hayvanlarda HA dokunun temel bileşenidir ve horoz ibiği, insan göbek bağı, eklem sıvısı ve göz küresinde bulunur. Bunlara ek olarak insan vücudundaki HA’nın neredeyse yarısı deri hücreleri içersinde tespit edilmiştir. Genel olarak HA horoz ibiğinden ekstrakte edilerek üretilmiştir, lakin ekstrakte edilen HA’nın içinde protein safsızlıklarının bulunması biyomedikal ve eczacılık alanlarındaki uygulamalar için büyüyen endişelere neden olmuştur. Bu sebepten dolayı, bakteriyel fermentasyon ile HA üretimi alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Son günlerde esas olarak kullanılan üretim yöntemi bakteriyel fermentasyondur. HA lineer bir polisakkarittir. Yüksek molekül ağırlıklı HA’nın yüksek nem tutma kapasitesi ve viskoelastisitesi, bunlarla beraber toksik özelliğinin olmaması ve vücuda girdiğinde bağışıklık sisteminin antikor üretmemesi gibi özellikler bu polisakkariti benzersiz kılmaktadır. Bu özellikler HA’nın estetik, artoloji (eklem bilimi), oftalmoloji (göz bilimi), onkoloji, yara iyileşmesi gibi çeşitli uygulama alanlarında yer bulmasını sağlamaktadır. Bu uygulama alanları için ham ya da modifiye edilmiş HA kullanılmaktadır. HA’nın bu alanlarda kullanılabilmesi için kimyasal yapısının kesin olarak analiz edilmesi gerekmektedir. İnfrared spektroskopi, ninhidrin analizi ve nükleer manyetik rezonans yapısal analiz için en sık kullanılan yöntemlerdir. Sıralanan yöntemler arasında, kolay numune hazırlanması ve kısa analiz süresinden dolayı hidrojen nükleer manyetik rezonans (1H-NMR) spektroskopi en çok kullanılan analiz yöntemidir. Fakat, her polielektrolit gibi HA polimer zincirlerinin çok seyreltik polimer çözeltisinde bile birbirleri ile etkileşmesi, geleneksel çözelti 1H-NMR ile HA’nın analizini oldukça zorlaştırmaktadır. HA polimer zincirlerinin birbiri ile etkileşimi çok seyreltik çözeltinin bile yüksek viskozite göstermesine neden olur, ayrıca proton hareketliliğini etkileyerek 1H-NMR spektrumunda hangi fonksiyonel gruba ait olduğunun belirlenmesi zor olan geniş piklerin oluşmasına neden olur. Yüksek viskoziteli sulu HA çözeltileri jel benzeri özellik gösterir. Jeller hareketli ve hareketsiz olmak üzere iki farklı bölgeden oluşur. Geleneksel çözelti 1H-NMR metodu ile sadece hareketli bölgedeki hidrojenler analiz edilebilir. Polimerin hareketsiz bölgesindeki hidrojenlerin analizi için katı-hal 1H-NMR metodunun kullanılması gereklidir. HA’nın sulu çözeltisinde, polisakkarite ait hareketsiz bölgenin varlığını göstermek amacıyla katı-hal 1H-NMR analizi yapılmış ve elde edilen spektrumda HA’nın anomerik, asetil ve şeker iskeletindeki hidrojenler belirlenmiştir. Böylelikle sulu çözeltideki HA’nın çözelti 1H-NMR ile gözlenemeyen hareketsiz bölgenin varlığı gösterilmiştir. Polimer çözeltilerinin iyonik gücünü ve pH’ını değiştirerek hareketsiz polimer bölgelerini hareketli hale getirmek mümkündür. Bu çalışmada bu iki parametre değiştirilerek hareketsiz bölgedeki protonların hareketli hale getirilmesi ve bu değişikliğin HA polimerinin konformasyonuna etkisinin incelenmesi, ayrıca konformasyon ile proton hareketliliği arasında bir bağlantı kurulması hedeflenmiştir. HA’nın haraketsiz bölgelerinin hareketli hale getirilerek 1H-NMR ile görülür olması ve bütün protonların görülür olduğu 1H-NMR spektrumu kullanılarak modifiye edilmiş HA’nın sübstitüsyon derecesinin doğru şekilde hesaplanması amaçlanmıştır. Çalışmamızda, yüksek molekül ağırlıklı mikrobiyal HA (1,5 milyon g/mol) kullanılmıştır. Analizler için katı HA belirli türde ve konsantrasyonda reaktif içeren çözeltilerde çözünmüştür. Bu çözeltiler şu şekildedir: 0,075 M, 0,125 M, 0,5 M, 1 M, 2 M sodyum klorür (NaCl); 0,071 M, 0,125 M, 0,25 M, 0,5 M, 1 M sodyum hidroksit (NaOH); 0,25 M, 1 M, 4 M üre; 0,5 M sülfürik asit (H2SO4) ve 0,5 M hidroklorik asit (HCl). Proton hareketliliğini belirlemek için döteryum oksitli reaktif çözeltileri kullanılarak 4 mg/mL HA çözeltisi hazırlanmıştır, standart olarak disodyumsüksinat hazırlanan çözeltilere eklenmiş, 1H-NMR ile analiz sonucu elde edilen spektralardan proton hareketliliği hesaplanmıştır. Her bir reaktifin HA’nın proton hareketliliği üzerinde etkisi incelendiğinde, en fazla hareketlilik NaOH eklenmesiyle sağlanmıştır, ve bunu sırasıyla NaCl, H2SO4 , HCl ve üre takip etmektedir. En yüksek proton hareketliliği 0,5 M NaOH içersinde gözlenmiştir. HA’nın her bir reaktif çözeltisi içindeki jirasyon (Rg) ve hidrodinamik yarıçapı (Rh) statik ve dinamik ışık saçılması tekniği ile belirlendi. İçsel viskozite ([η]) ise viskozimetrik ölçüm sonuçlarının excel’de hazırlanan programda kullanılmasıyla hesaplandı. Reaktiflerin Rg, Rh, [η] üzerindeki etkisi incelendi. Elde edilen sonuçlara göre artan NaCl, NaOH konsantrasyonu ile Rg değeri küçülmekte, fakat artan üre konsantrasyonu ile tersine Rg değeri artmaktadır. Rg değerinde en fazla azalmaya NaOH reaktifi neden oldu. Rh üzerindeki etki incelendiğinde ise, tüm reaktiflerin artan konsantrasyon ile HA zincirlerinin Rh değerinin azalmasına neden olduğu gözlendi. En fazla azalma yine NaOH ile gözlendi. Reaktiflerin içsel viskozite üzerindeki etkisi, hidrodinamik yarıçap üzerindeki etkisi ile aynı şekildedir. Rh ve içsel viskozite birbirine bağlı iki parametre olduğundan bu sonuç beklenilmektedir. Bulunan Rg, Rh, [η] değerleri proton hareketliliğine karşı grafiğe geçirildi. Her üç grafik için de benzer bağlantı bulundu, artan Rg, Rh, [η] sonucu proton hareketliliği azaldı. Rg’ye karşı proton hareketliliği grafiğinde, HA 103-112 nm aralığındaki jirasyon yarıçapı ile en yüksek proton hareketliliğini gösterdi. Grafikte 112-160 nm arasında proton hareketliliğinde keskin azalma gözlenirken, 160 nm’nin üzerindeki jirasyon yarı çaplarındaki artış proton hareketliliği üzerinde kayda değer etki göstermedi ve en düşük proton hareketliliği bu bölgede gözlendi. Grafikteki veriler göz önüne alındığında 103-112 nm arasında HA zincirlerinin sıkıştırılmış küre konformasyonu, 112-160 nm arasında sıkıştıtılmış küre konformasyonunun gittikçe genişlediği ve zincirlerin birbiri ile örtüşmeye başladığı, 160 nm üzerinde ise daha da genişlemiş yapı ile zincirlerin birbirine dolanıp HA çözeltilerinin jel özelliği gösterdiği sonucuna varılmıştır. [η]’ye karşı proton hareketliliği grafiğinde bir dönüm noktası gözlendi. Bu dönüm noktası HA polimer zincirlerinin birbirine değdiği ve üst üste bindiği zincir örtüşme noktasını göstermektedir. Bu grafikten zincir örtüşme noktası 1233,3 ml/g olarak belirlendi. Zincir örtüşme noktasının üstünde HA zincirleri birbiri ile kuvvetli şekilde etkileşmekte ve bu noktadan sonra artan içsel viskozite ile birlikte proton hareketliliği keskin şekilde azalmaktadır. Grafikten elde edilen bu bilgiler doğrultusunda, zincir örtüşme noktasından daha düşük viskoziteye sahip olan HA çözeltilerinde polimer zincirleri birim çözücü hacminde birbirinden bağımsız olarak hareket edebilmektedir, zincir örtüşme noktası ile eş viskoziteye sahip HA çözeltilerinde polimer zincirleri birim çözücü hacmini tamamen doldurmakta, birbirine değmeye ve üst üste binmeye başlamaktadır. Zincir örtüşme noktasının üstünde ise HA çözeltilerinde polimer zincirleri birbiri içine geçmekte, jel tipi karakter göstermektedir. Konformasyonu incelemek için her bir reaktif çözeltisindeki HA için ayrı ayrı Rg değerleri Rh’ya orantılandı. Elde edilen Rg/Rh değerleri proton hareketliliğine karşı grafiğe geçirildi. Rg/Rh değerleri ile HA için 3 farklı konformasyon belirlendi. Bunlar jel veya kümelenmiş sıkıştırılmış küreler, düzensiz sargı ve solucan benzeri zincirdir. HA çözeltileri en yüksek proton hareketliliğini solucan benzeri zincir konformasyonunda gösterdi. Polimer zincirlerinin boyutlarının küçülmesi ile HA çözeltilerinin yüksek viskoziteli, jel tipi özelliğinin kaybolduğu gözlendi. Bu durum polimer zincirleri birbiri ile güçlü biçimde etkileşemediğini ve moleküliçi ve moleküller arası hidrojen bağları zayıfladığını gösterdi. HA’nın çözelti içindeki yapısını belirleyen ve yapısal kararlılığı sağlayan hidrojen bağlarının olmaması halinde, polimer üzerindeki hidrojenler çözelti içersinde daha fazla hareket edebilir ve bu da hidrojenlerin çözelti 1H-NMR analizlerinde görünür olmasını sağlar. Yaptığımız çalışma sonucunda HA’nın maksimum proton hareketliliği solucan benzeri zincir konformasyonunda 103 nm Rg, 46 nm Rh ve 581,5 mL/g içsel viskozite ile 0,5 M NaOH çözeltisi içinde belirlendi. Proton hareketliliğinin sübstitüsyon derecesi (DS) hesabı üzerindeki etkisi araştı-rıldı. Bu amaçla benzilamin ile modifiye edilmiş HA’nın sadece D2O ve 0,5 M NaOH içeren D2O içinde 1H-NMR analizleri yapıldı. %DS D2O içersinde %23, 0,5 M NaOH içeren D2O içinde %15 olacak şekilde hesaplandı. Yapılan deneyler sonucunda proton hareketliliğinin %DS hesaplamalarını büyük ölçüde etkilediği saptandı. Sonuç olarak, bu çalışmada proton hareketliliği ile polimer boyutu arasında direkt ilişki bulundu. Kullanılan reaktif ve çözücüden bağımsız olarak, HA ve benzer yapıdaki polimerlerin sadece çözelti içersindeki boyutu ölçülerek proton hareketliliği saptanabilir. Doğru NMR ölçümleri için polimer boyutunun zincir örtüşme noktasının altında olması gereklidir.
Hyaluronic acid (HA) is polysaccaride made of D-glucuronic acid and N-acetyl glucosamine repeating disaccaride units. The molecular weights of HA from different sources are highly variable, ranging from 104 to 107 Da. HA is in the form of sodium salt in the physiological conditions, hence negatively charged and shows polyelectrolyte properties. It is essential component of tissues in the vertebrate organism and found in the rooster comb, human umbilical cord, synovial fluid and eye bovine. Furthermore, almost half of the human body’s HA occours intracellularly in skin. Traditionally HA extracted from rooster comb, however, due to existence of the protein impurities this processes is facing growing concern. Hence, bacterial fermentation is emerged as an alternative method for HA production and now mainly bacterial production is used. The high molecular HA has unique properties like moisturising retention ability and viscoelasticity, coupled with its lack of immunogenicity and toxicity. These properties provides a wide range of application areas such as aesthetic medicine, arthrology, ophthalmology, oncology and wound healing. For increase the residence time of HA in vivo is necessarily modified HA can be used. It is really significant to determine exact structural information about the HA. Infrared spectroscopy, ninhydrin assay and nuclear magnetic resonance spectroscopy are the methods used for structural characterization. Among these methods hydrogen nuclear magnetic resonance (1H-NMR) spectroscopy is the most common method due to easy sample preparation and short analysis time. However, it is not easy to perform solution 1H-NMR analysis of HA because as all electrolytes HA chains interact with each other even at dilute solution. This behaviour produces highly viscous solutions at very low concentrations, also affects the proton mobility and cause broad signals in spectra which is not easy to assign. Highly viscous HA aqeous solutions show gel like behaviour. Gels consist of mobile and immobile regions. With solution 1H-NMR only protons of mobile region are visible, for characterize immobile region solid state 1H-NMR must be used. Immobile region of HA is proved by solid state 1H-NMR; acetyl, sugar backbone, anomeric protons are determined. It is possible to turn the immobile region to mobile one by changing ionic strength and pH. By changing these two parameters the proton mobility is investigated and a correlation between proton mobility and the conformation of HA in solution is found. In this study, high molecular weight microbial HA (1,5 million g/mol) is investigated. Solid HA is dissolved in the reagent solutions as 0,075 M, 0,125 M, 0,5 M, 1 M, 2 M sodium chloride (NaCl), 0,071 M, 0,125 M, 0,25 M, 0,5 M, 1 M sodium hydroxyde (NaOH), 0,25 M, 1 M, 4 M urea, 0,5 M sulfuric acid (H2SO4) and 0,5 M hydrochloric acid (HCl). For proton mobility determination, 4 mg/mL HA in reagents solutions with deuterium oxide are prepared, measured by 1H-NMR and from the obtained spectra proton mobility is calculated. Radius of gyration (Rg) and hydrodynamic radius (Rh) of HA in solutions are obtained by light scattering technique, intrinsic viscosity ([η]) is by viscosimetric measurements. Determined Rg, Rh, [η] values were plotted against proton mobility. It has been shown, that there is inverse correlation, while the Rg, Rh, [η] values increase the proton mobility decrease. Rg vs. proton mobility graph shows that, HA with 103-112 nm range has highest proton mobility. Between 112-160 nm proton mobility decreases sharply, over 160 nm there is no significant change and has the lowest mobility. In the [η] vs. proton mobility, one turning point is obtained in the trend. This turning point is the chain overlap point where the HA chains start to touch and overlap. Chain overlap point is determined as 1233,3 ml/g. Above this viscosity HA chains fill the solvent volume totally and they interact efficiently, as a result proton mobility decreases sharply. In order to investigate the effect of conformation of HA on the proton mobility, Rg/Rh is calculated and plotted against to proton mobility. The graph showed that HA has highest proton mobility with worm like rod conformation. In this study, results showed that HA solutions lose their highly viscous, gel like behavior with decreasing dimension of polymer coils in solution. Chains cannot interact effectively and intra- and intermolecular hydrogen bonds get weaker. As a result of absence of strong non-covalent interactions hydrogens can tumble freely and become visible in solution 1H-NMR. Maximum proton mobility of HA is determined in worm like rod conformation with the 103 nm Rg, 46 nm Rh and 581,5 mL/g intrinsic viscosity. In order to investigate the effect of proton mobility on the calculation of degree of substitution, 1H-NMR analysis of benzylamine modified HA has been done in D2O and D2O with 0,5 M NaOD. DS% is calculated as 23% and 15% for benzylamine modified HA in only D2O and D2O with 0,5 M NaOD, respectively. We found that proton mobility affects the calculation of degree of substitution, by using the new method we proved it is possible to obtain correct degree of substitution. In conclusion, this study obtained direct correlation between proton mobility and polymer dimension. Independent of added reagent or solvent, it is possible to determine the proton mobility of same or similar polymer studied just by measuring the dimension of polymer in solution. The dimension of polymer must be under the chain overlap point in order to perform correct NMR measurement.
Açıklama
Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2016
Anahtar kelimeler
Hyalüronik Asit, Proton Hareketliliği, Konformasyon, 1h-nmr, Sübstitüsyon Derecesi Hesabı, Hyaluronic Acid, Proton Mobility, Conformation, 1h-nmr, Degree Of Substitution Calculation
Alıntı