Ayranın (içilebilir Yoğurt’un) Nano-lipozomal Sistemler İle Enkapsüle Endilen Kakao Kabuğu Atığı Ekstraktı İle Zenginleştirilmesi: Raf Ömrü Ve Biyoyararlılık Çalışmas

Abstract

Bu tezde, ayran enkapsüle edilen kakao kabuğu fenolikleri ile zenginleştirilmiştir (1:10 w/w). Enkapsülasyonda nano-lipozomal sistemler olan kitosanla kaplı ikincil ve püskürtmeli kurutulmuş lipozomlar kullanılmıştır. Kakao kabuğu fenoliklerinin bu sistemler ile korunma seviyeleri ve biyoyararlılıkları ayran formülasyonunda raf ömrü süresince incelenmiştir. Zengin fenolik içeriğine sahip kakao kabuğu atığı ekstraktının içerdiği biyoaktif bileşenlerin nano-lipozomal sistemler ile enkapsüle edilmesi ile bu aktif bileşenler olumsuz çevre koşullarıdan korunmuş olmakta ve bu bileşenlerin biyoyararlılıkları arttırılmaktadır. Bu çalışmada kakao kabuğu atığı ekstraktı iyi-dağılımlı aniyonik lipozomlar ile farklı konsantrasyonlarda (0,1-0,9 %) enkapsüle edilmiştir. Lipozomların enkapsülasyon veriminin ve partikül büyüklüklerinin ekstrakt konsantrasyonuna bağlı olduğu gözlemlenmiştir. Enkapsülasyon veriminin tespiti için toplam fenolik madde miktarı, toplam antioksidan miktarı ve toplam flavonoid madde miktarı spektrofotometrik yöntemler kullanılarak tespit edilmistir. Toplam fenolik madde miktarı tayininde Folin–Ciocalteu, toplam antioksidan madde miktarı tayininde CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity) ve DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) metotları kullanılmıştır. 0,2% ağırlık/hacim konsantrasyonda maksimum enkapsülasyon verimi elde edilmiştir. Bu konsantrasyonda partikül büyüklüğü 157 nm ve ζ –potansiyali – 25 mV olarak ölçülmüştür. Lipozomun yapısal dayanıklılığını arttırmak için lipozom yüzeyi kitosan ile kaplanmış ve daha sonra püskürtmeli kurutucu kullanılarak yüzeyleri kitosan ile kaplanan lipozomlar toz hale getirilmiştir. Kitosan ile kaplanmamış olan birincil lipozomların yüzeyleri tabaka tabaka depozisyon yöntemi kullanılarak katyonik kitosan (0,4 ağırlık/hacim %) ile kaplanmış ve maltodekstrin (20 ağırlık/hacim %) ile karıştırıldıktan sonra püskürtmeli kurutucu ile katı forma getirilmiştir. Birincil lipozomların kitosan ile kaplanmış ikincil lipozomların ve toz forma getirilen lipozomların enkapsülasyon verimleri karşılaştırılmış, sonuç olarak; toz formdaki lipozomların en yüksek enkapsülasyon verimine sahip olduğu tespit edilmiştir. Bunların yanı sıra dondurularak kurutulmus kakao kabuğu atığı exkstraktının, püskürtmeli kurutucuda kurutularak toz forma getirilmiş kakao kabuğu atığı exkstraktının, ikincil lipozomlardaki kakao kabuğu atığı exkstraktının ve toz formdaki lipozomlardaki kakao kabuğu atığı ekstraktının içerdiği biyoaktif bileşenlerin in vitro sindirimi öncesi ve sonrası korunumları spektrofotometrik yöntemler (toplam fenolik madde miktarı, toplam antioksidan miktarı ve toplam flavonoid madde miktarı tespiti) kullanılarak karşılaştırılmış sonuç olarak toz formdaki lipozomların en iyi korumayı sağladığı tespit edilmştir. Buna ilaveten lipozom ile enkapsüle edilen kakao kabuğu atığı ekstarktlarındaki biyoaktif bileşenler in vitro sindirim sırasında enkapsüle edilmeyenlere göre daha az degradasyona uğramıştır. Lipozom yüzeyinin kitosan ile kaplanması lipozom yapısını sağlamlaştırmış toz forma getirmek yapıyı daha da dayanıklı hale getirmiş ve biyoyararlılığı arttırmıştır. Kakao kabuğu fenoliklerinin biyoyararlılıkları diğer örneklere göre püskürtmeli kurutulmuş lipozomlarda en az 4 kat daha fazla bulunmuştur. Ultra yüksek performanslı sıvı kromotografisi kullanılarak enkapsüle edilmemiş (dondurarak kurutulmuş ve püskürtmeli kurutucuda toz forma getirilmiş) ve enkapsüle edilmiş (kitosan ile kaplı olan ikincil lipozomlar ve püskürtmeli kurutucu ile toz forma getirilen lipozomlar) olan kakao kabuğu atığı ekstraktının biyoyararlılıkları ve in vitro sindirim öncesi ve sonrası fenolik asit profilleri araştırılmış sonuç olarak 10 temel fenolik bileşen tespit edilmiştir bu bilesenler flavon-3-ol monomerleri, flavan (quercetin) and phenolic asitlerden meydana gelmektedir. Tespit edilen fenolik bileşenlerin mide-bağırsak sistemindeki in-vitro sindirimi fenolik bileşenlerin molekül yapısına ve lipozomdaki miktarlarına ve lipozomda bulundukarı yere (lipozomun iç tabakası olarak adlandırılan korda ya da lipozomun yüzeyinde) göre farklılıklar göstermektedir. Bunların yanı sıra fenolik bileşenlerin karbonhidrat ve yağ molekülleri ile etkileşimi bu bileşenlerin degradasyon seviyelerini ve biyoyararlılıklarını etkileyen bir diğer önemli parametredir. Yaptığımız çalışmalar göstermiştir ki; lipozom ile enkapsülasyon, biyoaktif bileşenlerin daha iyi korunmasını sağlayarak biyoyararlılıklarını arttırmıştır. Bununla beraber ikincil lipozomlar ile toz forma getirilen lipozomlar karşılaştırıldığında toz forma getirilen lipozomların biyoyararlıklılarının ve koruma seviyelerinin daha iyi olduğu tespit edilmiştir Tüm bu veriler ışığında ayran toz formdaki kitosan ile kaplanan lipozom ile enkapsüle edilmiş kakao kabuğu atığı ekstraktı ve sıvı formdaki kitosan ile kaplanan lipozom (ikincil) ile enkapsüle edilmiş kakao kabuğu atığı ekstraktı ile zenginleştirilmiştir. Sıvı bir ürün olan içilebilir yoğurda toz forma getirililmiş lipozomal yapıların katılmasının biyoaktif bileşenin korunması ve bu biyoaktif bileşenlerin biyoyararlılığına olan etkisi incelenmiştir. Bunun yanı sıra enkapsülsyonun kakao kabuğu atığı ekstraktındaki biyoaktif bileşenlerin korunumu ve biyoyararlılığı üzerine olan etkilerini tespit edebilmek için içilebilir yoğurt aynı zamanda; dondurularak kurutulmus kakao kabuğu atığı ekstraktı ve püskürtmeli kurutucuda toz forma getirilmiş kakao kabuğu atığı ekstraktı ile de zenginleştirilmiştir. Kontrol grubu olarak zenginleştirilme yapılamamış olan ayran örnekleri kullanılmıştır. Tüm ayran örnekleri 4°C depolanmış ve raf ömrü boyunca (15 gün) biyoaktif bileşenlerin korunumu ve biyoyararlılıkları incelenmiştir. Toz formdaki lipozom ile enkapsüle edilmiş kakao kabuğu atığı ekstraktı, ikincil lipozom ile enkapsüle edilmiş kakao kabuğu atığı ekstraktı, dondurularak kurutulmuş kakao kabuğu atığı ekstraktı ve püskürtmeli kurutucuda toz forma getirilmiş kakao kabuğu atığı ekstraktı ile de zenginleştirilen ayran örneklerindeki biyoaktif bileşen miktarları; toplam fenolik madde, toplam antioksidan madde ve toplam flavonoid madde miktarlarının spektrofotometrik yöntemler ile analizlenmesi ile tespit edilmiştir. Analizler 1. 5. 10. ve 15. günlerde in vitro sindirim öncesi ve sonrası yapılmış, raf ömrüne bağlı olarak znginleştirilmiş içilebilir yoğurt örneklerinin biyoyararlılıkları ve kakao kabuğu ekstraktlarındaki biyoaltif madde miktarlarındaki korunum incelenmiştir. Ayran, püskürtmeli lipozomlar ile zenginleştirildiğinde; kakao kabuğu fenoliklerinin korunumu dondurularak kurutulmuş kakao kabuğu fenolikleri ile zenginleştirmeye göre raf ömrü süresince in-vitro sindirim öncesi 2 kat sonrası, 5 kat artmıştır. Bu iki ayran örneği karşılaştırıldığında; püskürtmlei kurutulmuş lipozomlardaki kakao fenoliliklerinin raf ömrü boyunca biyoyararlılıklarının en az 7 kat arttığı saptanmıştır. Raf ömrü süresince ayran örneklerindeki kakao kabuğu atığı ekstraktlarının biyoaktif madde profili; in vitro sindirim öncesi ve sonrası ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile tanımlanmıştır. Tespit edilen fenolik maddeler, ayran ürününe katmadan önce dondurulmuş kakao kabuğu ekstraktındaki, püskürtmeli kurutucuda toz forma getirilmiş kakao kabuğu ekstraktındaki, ikincil lipozomdaki kakao kabuğu ekstraktındaki ve toz forma getirilmiş lipozomdaki kakao kabuğu ekstraktındaki biyoaktif bileşenler ile aynı olup; bozunma seviyelerine bağlı olarak bu biyoaktif bileşenlerin miktarları içilebilir ayran örnekleri arasında farklılık göstermektedir. Lipozomların yüzey yükleri lipozomun stabilitesini belirleyen önemli faktörlerden biridir. Aktif yüzey yüklerine sahip olan lipozomların bulundukları ortamdaki diğer moleküller ile etkileşime girmeleri ile lipozomların yapıları dağılabilir. Ayranın lipozomal yapılar kullanılarak biyoaktif bileşenlerce zenginleştirildiği bu çalışmada, lipozomlar ve ayran proteinlerinin etkileşimi lipozomların raf ömrü süresince dayanıklılığını etkileyen önemli faktörlerden biridir. Raf ömrü süresince in-vitro sindirim öncesi ve sonrası yapılan ultra yüksek performanslı sıvı kromotografisi analizlerinde ayrana katılmış olan toz forma getirilmiş lipozomların; ikincil lipozomlara göre kakao kabuğu atığı ekstraktlarındaki biyoaktif bileşenleri daha iyi koruduğu ve bu bileşenlerin biyoyararlılıklarını arttırdığı tespit edilmiştir. Bunlara ek olarak, lipozom ile enkapsüle edilmiş kakao kabuğu atığı ekstraktlarındaki biyoaktif bileşenler; enkapsüle edilmeyenlere göre ayranda raf ömrü süresince in-vitro sindirim öncesi ve sonrası daha az degrade olmuştur. Litaretürde yoğurt ve yoğurt ürünlerinin polifenolik ve fenolik maddelerce zenginleştirilmesi ile ilgili mevcut çalışmalar bulunmaktadır. Bununla beraber, lipozom ile enkapsüle edilerek korunumu ve biyoyararlılığı arttırılmış olan biyoaktif maddelerin ayrana katılması ve lipozomların bir gıda matrisi içerisindeyken biyoyararlılık çalışmasının yapılması bir ilktir. Bunların yanı sıra, bu çalışma tuz içeren geleneksel bir Türk içeceği olan ayranın biyoaktif maddelerce zenginleştirildiği ve raf ömrü süresince biyoyararlılık çalışmalarının yapıldığı ilk çalışmadır.

In this thesis, ayran (drinking yoghurt) was fortificated (1:10 w/w) with encapsultated cocoa hull phenolics which extracted from cocoa hull waste. Nano-liposomal systems were used for encapsulation that were chitosan coated (secondary) liposomes and spray dried liposomes. The protection level of cocoa hull phenolics and their biovailability in these systems were investigated in fortificated ayran (drinking yoghurt) during shelf life period. Cocoa hull waste was a phenolic rich source and encapsulation of these bioactive compounds in nano-liposomal system was an intelligent way both to protect them negative environment conditions and to increase their bioavaibility. In these study we encapsulated cocoa hull waste extract (CHWE) by fine-disperse anionic liposomes with different concentration (0.1-1.0 %). Encapsulation efficiency of liposomes was depended on extract concentration which also effect the particle size of liposomes. The maximum encapsulation efficiency was found 73.6% in concentration 0.2% w/v and the particle size is 157 nm, the ζ –potential is – 25 mV at this concentration. To enhance the liposome structure, their surface was coated with chitosan and then were solidificated by spray dryer. Layer-by-layer deposition method was used for coated the primary anionic liposomes with cationic chitosan (0.4 w/v%) and before the spray drying they mixed with maltodextrin (MD) (20 w/v%). Change of encapsulation efficiency (EE%) of bioactive compounds in primary, chitosan coated (secondary) and spray dried liposome was investigated, the spray dried liposome had the higher EE%. The protection of cocoa hull phenolics by liposomal systems during in-vitro digestion was investigated by comparing freeze dried CHWE, spray dried CHWE, secondary liposome with CHWE and spray dried liposome with CHWE. The better protection of bioactive compounds in gastro-intestinal digestion (in-vitro) was supported by spray dried liposomes. It is showed that covering the liposomes with chitosan layer provided the liposome stability and getting them to dry powder forms enhanced both stability and bioaccessibility. The bioavailability of these compounds in spray dried liposome at least 4 times higher than freeze dried forms. The phenolic acids profile and their bioavailability of CHWE and the CHWE in nano-liposomal systems was determined by in ultra high performance liquid chromatography (UHPLC). There was detected 10 major phenolic compounds. Their stability in gastro-intestinal digestion showed differences which based on molecular structure of phenolic acids and their location in the liposome. The bioactive compounds of cocoa hull were protected better in spray dried liposomes compared with secondary liposome, spray dried CHWE and freeze dried CHWE. The cocoa hull waste contained both flavon-3-ol monomers, flavan (quercetin) and phenolic acids. The interaction of these compounds with carbohydrate and oil bases molecules was an important parameter of their degradation level and bioavailability. In addition, the content and location of them in liposome structure (interior or surface) is another factor to determine the protection degree. According to these datas, the ayran (drinking yoghurt) was enriched with both encapsulated and unencapsulated cocoa phenolics which extracted from cocoa hull waste. To determine the protection level of liposomes and their effect of bioaccessibility; freeze dried cocoa hull waste extract (CHWE), spray dried CHWE, chitosan coated liposome (secondary liposome) with CHWE and spray dried chitosan liposome with CHWE were used for fortification. Protection of bioactive compounds which were total phenolic compound (TPC), total antioxidant compound (TAC) and total flavonoid compound (TFC) in fortificated ayran (drinking yoghurt) samples was investigated before and after in-vito digestion during the shelf-life period (1st, 5th and 10th and 15th day) at 4oC storage temperature. Spray dried liposome showed the highest protection level of phenolic compounds both before and after in-vitro digestion which were at least 2 times and 5 times higher than ayran (drinking yoghurt) with freeze dried CHWE before and after in-vitro digestion, respectively. The bioavailabilty of CHWE phenolics in ayran (drinking yoghurt) were increased at least 7 folds when they are added with spay dried liposomes, instead of freeze dried CHWE. The CHWE phenolic profile of ayran samples were identified by UHPLC, and determined these compounds in ayran samples during shelf-life period. The spray dried liposomes showed the better protection of all phenolic compounds in ayran during shelf life period. In addition, liposomal systems showed the better protection level of phenolics both before and after in-vitro digestion. The surface charge of liposomes and their interaction of other food components, especially ayran proteins was an important parameter for liposome stability, as spray dried liposomal systems provided higher protection of phenolics compared with secondary liposomes during shelf life. There are several studies about fortification of yoghurt and yoghurt products with polyphenol extracts, but using the liposomal encapsulation of polyphenols is the first study for enrichment the ayran (drinking yoghurt). In additon these is the first study about fortification of ayran, which is a traditional fermented milk beverage in Turkey and contain salts, with polyphenol extracts.