Helikobakter – İnfekte Mide Epitel Hücrelerinden Baff Üretiminin Ve Sinyal Yolağının Moleküler düzeyde Araştırılması

Abstract

Helikobakter pilori (H.pilori) gram –negatif, spiral şekilli, mikroaerofilik bir bakteri olup insan midesinde kolonize olmakla beraber kronik gastrit, gastrit adenokarsinoma , ülcer ve gastik lenfomayla yakından ilişkili olan bir bakteridir. Gelişmekte olan ülkelerin %80’i Helikobakter pilori ile infektedir fakat bireylerin çoğu asemptomatiktir. Bakteri virülans faktörleri, konağın genetik özellikleri ve çevresel etkenler Helikobakter ile ilişkili hastalıklardın gelişmesinden sorumludur. H. pilori kaynaklı mide enflamasyonu çocuklarda foliküler gastrite, yetişkinlerde ise MALT(mukoza ilişkili lenfoid doku) lenfomaya sebep olmaktadır. Bu iki hastalık da B hücre folikülleri varlığı ile karakterizedir. H. pilori’nin mide epitel hücrelerini etkileyerek gastrik immunopatoloji oluşumunda katkısını anlayabilmek amacıyla, araştırmamızda H. pilori ile enfekte mide epitel hücreleri tarafından üretildiği gösterilen B hücre aktive edici sitokin (BAFF) üzerinde yoğunlaşmaktayız. TNF (tümör nekrozis faktör) ailesi üyelerinden olan BAFF ilk olarak 1999’da keşfedilmiş olup, BLys, THANK, TALL-1, zTNF4, TNFSF13B adları ile de anılmakadır. BAFF, insanlarda 13. kromozomun uzun kolunda kodlanmakta ve 6 adet ekzonu bulunmaktadır. BAFF, doğustan ve sonradan kazılan bağışıklıkta regüle edici özelliği bulunan bir sitokindir. Aynı zamanda B hücre matürasyonu, proliferasyonunda, yaşamı, geşilmesi, farklılaşmasında görev alan bir sitokindir. BAFF çeşitli hücrelerce üretilmektedir. Örneğin monositler, nötrofiller, dendritik hücreler, aktive olan T hücreleri, epitel hücreler, makrofajlar tarafından üretildikleri gösterilmiştir. BAFF’ın aynı zamanda kanser hücrelerinden de üretildiğini gösteren çalışmalar vardır. Romatoid artrit (RA), Sjögren sendromu (SS), multiple skleroz (MS), deneysel otoimmün ensefalomiyelitis (EAE) ve sistemik lupus eritamatozus (SLE) gibi otoimmün hastaların serumlarında yüksek düzeyde BAFF saptanmıştır. APRIL (proliferasyon indükleyici ligand), BAFF’ın homoloğu olan ve yine TNF ailesine ait bir sitokindir. Çalışmalarımız H.pilori G27 WT sonikatı ile stimule edilen gastrik epitel hücrelerinden APRIL ekspresyonu ve üretimi ile devam etmiştir. APRIL, TRDL-1, TALL-2 and TNFSF-13a gibi isimlerle de terimlendirilir. İnsanlarda 17. kromozomun küçük kolunda yer alıp , 6 ekzona sahiptir. APRIL da monositik, dendritik, epitel , makrofaj ve çeşitli kanser hücrelerince üretilmektedir. APRIL’ın plasma B hücrelerinin proliferasyonunu ve daha çok tümor hücrelerini stimüle edici özelliği olduğu literatürde gösterilmiştir. APRIL’ın da yüksek düzeyde otoimmün hastaların serumlarında bulunduğu gösterilmiştir. Bu çalışmamızda H.pilori virulans faktörlerinden Cag A (sitotoksin- ilişkili gen A) virulans faktörünün gastik epitel hücrelerinden BAFF ve APRIL üretimine etkisi ve sinyal yolakları araştırılmıştır. Cag A, H.pilori’nin en önemli virulans faktörlerinden biri olup gastrik hastalıklarının gelişmesinde önemli rol oynadığı gösterilmiştir. Bu amaçla mide epitel hücresi olan KATO-III, yabanıl (WT) H.pilori G27 suşu ve onun ΔCag A (Cag A virulans faktörü bulunmayan) mutantı ile muamele edilmiştir. mRNA seviyelerindeki BAFF ekspresyon farkları kantitatif- gerçek zamanlı PZR ile tayin edildi. Elde edilen bulgular H.pilori G27 WT sonikatının incelenen KATO-III hücre hattında BAFF üretimine sebep olduğunu göstermektedir. H.pilori G27 ΔCag A mutantı sonikatı ile muamele edilmiş KATO-III hücrelerindeki BAFF ekspresyonu, H.pilori G27 WT sonikatı ile muamele edilmiş hücrelere göre daha düşük seviyelerde bulunmuştur. Bu sonuç bize Cag A virulans faktörünün BAFF üretimi üzerindeki etkisini göstermektedir. Protein düzeyinde yapılan Western Blotlama ve BAFF ELIZA çalışmalarının sonuçları gösterdi ki, BAFF üretimi H. pilori G27 WT ile muamele edilmiş hücrelerde daha fazla saptanmıştır. RNA ve protein düzeyindeki çalışmalar birbirini tamamlamaktadır. APRIL eksresyonu da BAFF kadar yüksek düzeylerde olmasa da H.pilori G27 WT ile muamele edilen KATO-III hücrelerinde APRIL ekspresyonu daha fazla miktarda gözlenmiştir. Protein düzeyindeki Western Blotlama çalışmalarına göre de APRIL üretiminde Cag A virulans faktörünün önemli rol oynadığı gösterilmiştir. NOD1 (nükleotid bağlayıcı oligomerizasyon domain proteini 1), sitoplazmada bulunan bir hücre içi patojen tanıma reseptörü olup NLR (NOD-benzeri reseptör) ailesinin CARD bölegesi taşıyan bir üyesidir. Genellikle tüm gram-negatif ve bazı gram-pozitif bakterilerde bulunup, hücre duvarından kökenlenen peptidoglikanları tanımakla görevlidir. Helikobakter pilori’den kökenlenen peptidoglikanların NOD1 ekspresyonunu arttırtığı daha önce bağırsak epitel hücrelerinden gösterilmiştir. Bizim çalışmamızda da H.pilori G27 WT sonikatı ile muamele edilmiş mide epithel hücrelerinden üretilen NOD1 ekspresyonu ekspresyonu gerçek zamanlı PZR tekniği kullanılarak analiz edilmiştir. NOD1 ekspresyon sonuçlarına göre H.pilori G27 WT sonikatı ile muamele edilen hücreler, H.pylori sonikatı ile muamele edilmeyen hücrelere göre daha fazla NOD1 ekspres etmektedirler. Literatürde NOD1’ın IRF7 (interferon regülator faktör 7) ’nin nukleusa translokasyonunu sağlayarak IFN-β (İnterferon-beta) eksprese edilemesine yol açtığı bilinmektedir. Üretilen tip-I sitokin olan IFN-β ’nın da hücre yüzeyinde bulunan İnterferon-beta reseptörüne bağlanıp JAK/STAT yolağını aktive edici özelliği vardır. Bu bilgiler ışığında, bizim çalışmalarımızda H.pilori sonikatı ile muamele edilmiş KATO-III hücrelerinden IRF7’nin ve IFN-β’nın ekpresyonlarını kantitatif- gerçek zamanlı PZR tekniği kullanılarak araştırılmıştır. Kantitatif- gerçek zamanlı PZR sonuçlarına göre, H.pilori G27 WT sonikatı muamele edilen hücrelerdeki IRF7’nin ekspresyonudaki artışın H.pilori sonikatı ile muamele edilmeyen hücrelere göre fazla olduğu gözlenmiştir. IRF7 ekspresyon sonuçlarını takiben H.pilori G27 WT sonikatı ile muamele edilmiş hücrelerden IFN-β sitokinin ekpresyon düzeyindeki analizleride kantitatif- gerçek zamanlı PZR ile araştırılmıştır. Elde edilen bulgulara göre, H.pilori G27 WT sonikatı varlığında IFN-β’nın üretiminin H.pilori sonikatı ile muamele edilmeyen KATO-III hücrelerine göre daha fazla ekprese edildiği gösterilmiştir. Literatürde hava yolu aracılı epitel ve tükürük bezi epitel hücrelerinden BAFF üretiminin JAK/STAT (Janus tirozin kinaz /sinyal ileticisi ve transkripsiyon aktivitörü) aktive edici yolağı aracılı ile olduğu gösterilmiştir. Çalışmamızda H.pilori G27 WT sonikatı ile infekte mide epitel hücrelerinde ki BAFF üretim yolağının aydınlatılması amaçlanmıştır. Bu amaçla H.pilori G27 WT sonikatı ile indüklenen hücrelerden JAK/STAT sinyal yolağını aydınlatmak için KATO-III hücreleri çeşitli dozlarda JAKI (JAK inhibitörü) ile muamele edilip ardıdan H.pilori G27 WT sonikatı ile stimule edilmiştir. Elde edilen Western Blotlama sonuçlarına göre JAKI kullanıldığında STAT1’ in fosforilasyonundaki azalma gösterilmiştir. BAFF ve APRIL ekspresyonu ve üretimide JAKI kullanıldığında azalmaktadır. BAFF ve APRIL üretiminde JAK/STAT sinyal yolağının mide epitel hücrelerinde de rol oynadığını göstermiştir.

Helicobacter pylori (H.pylori) is a gram negative, spiral –shaped, microaerophilic bacterium which colonize in the human stomach and is significantly associated with chronic gastritis, gastric adenocarcinoma, gastric ulcers and gastric lymphoma. In developing countries, 80% of the population is infected with Helicobacter pylori but most of them are asymptomatic. The bacterial virulence factors, host genetic traits, and environmental parameters are responsible for the Helicobacter-associated diseases. H.pylori-driven inflammation in stomach leads to follicular gastritis in childhood and MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) lymphoma in adults, both of which are characterized by the presence of B cell follicles. To understand the contribution of H.pylori on gastric immunopathology formation indirectly through affecting gastric epithelial cells in molecular level, we focus on B cell activating factor (BAFF), which was shown to be produced in H. pylori-infected gastric epithelial cells. BAFF is a member of TNF (tumour necrosis factor) family and first identified in 1999. BAFF is also termed as BLys, THANK, TALL-1, zTNF4, TNFSF13B. BAFF is located on chromosome 13 in humans and has 6 exons. BAFF is responsible for regulation innate and adaptive immunity. It has a role on B cell maturation, proliferation, development and survival. BAFF is produced by many cell types including monocytes, neutrophils, dendritic cells, activated T cells, epithelial cells and macrophages. BAFF production is also reported from cancer cells. Elevated levels of BAFF were found in sera of several autoimmune diseases patients such as rheumatoid arthritis (RA), Sjögren’s syndrome (SS), experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), systemic lupus erythematosus (SLE). APRIL (a proliferation inducing ligand) is a homologue of BAFF and a member of TNF family cytokines. We also focus on H.pylori G27 WT sonicate- stimulated APRIL production from gastric epithelial cells. APRIL is also termed as TRDL-1, TALL-2 and TNFSF-13a. APRIL is located on chromosome 17 in humans and has 6 exons. APRIL is expressed by monocytic, dendritic, epithelial cells, macrophages and cancer cells. APRIL has a role on plasma cell survival and stimulation of tumour cells. High levels of APRIL were also found in sera of autoimmune disease patients. In this study, the effect of H.pylori virulence factor Cag A (cytotoxin- associated gene-A) on BAFF & APRIL production from gastric epithelial cells and their signalling pathway were investigated. It was reported that H.pylori virulence factor Cag A is associated with development of gastric malignancies. For that reason, a gastric epithelial cell line KATO-III was treated with wild- type (WT) H. pylori G27 strain sonicate and its ΔCag A mutant sonicate. The differences of BAFF expression in mRNA level were determined by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Our research indicates that BAFF is produced from H.pylori G27 WT sonicate- treated KATO-III cells. It was observed that BAFF expression is significantly decreased from H.pylori G27 ΔCag A sonicate- treated KATO-III cells compared to H.pylori G27 sonicate- treated cells. This result suggests that H.pylori virulence factor Cag A has an effect on BAFF production in KATO-III cells. BAFF protein levels were detected by using Western Blotting and ELISA. BAFF protein levels were also significantly increased in H.pylori G27 WT sonicate- treated KATO-III cells compared to untreated controls and H.pylori ΔCagA mutant sonicates- treated KATO-III cells had less BAFF production compared to H.pylori wild-type counterpart. Findings revealed a correlation between RNA and protein levels of BAFF in response to H.pylori G27 WT sonicate. APRIL was found to be expressed less than BAFF. Findings suggest that APRIL expression is significantly increased in H.pylori G27 WT sonicate- treated KATO-III cells. qRT-PCR and Western Blotting results indicates that H.pylori virulence factor Cag A has a role in APRIL expression and production. NOD1 (nucleotide –binding oligomerization domain) is an intracellular pattern recognition receptor and is found in the cytoplasm. NOD1 is a member of NLRs and contains CARD (caspase recruitment domain domain). NOD1 is present in all gram – negative bacteria and some gram - positive bacteria. It recognizes peptide derived peptidoglycans (PGNs) derived from bacterial cell walls. It is reported that H.pylori PGNs induce NOD1 expression in intestinal epithelial cells. In our work, NOD1 is also found to be expressed by H.pylori sonicates- treated KATO-III cells. It was observed that NOD1 expression is increased in H.pylori G27 WT sonicate- treated cells compared to untreated controls. It is known that activation of NOD1 leads to IFN-β (interferon-beta) expression via IRF7 translocation to nucleus. Secreted type I cytokine IFN-β, binds to its own receptor on the cell surface and activates JAK/STAT signalling pathway. In the light of this knowledge, we investigated IRF7 expression and IFN-β expression levels in H.pylori sonicates- treated KATO-III cells by using qRT-PCR. qRT-PCR results suggest that IRF7 expression level is increased in H.pylori G27 WT sonicate- treated KATO-III cells. Following IRF7 expression levels, IFN-β expression levels were also investigated by qRT- PCR. It was observed that IFN-β expression level was increased in H.pylori G27 WT sonicate- treated cells compared to untreated control. In literature, BAFF production is reported from different epithelial cells such as airway epithelial cells and salivary gland cells via JAK/STAT signalling pathway. We aimed to elucidate H.pylori G27 WT sonicate- stimulated BAFF signalling pathway in gastric epithelial cells. In order to investigate H.pylori G27 WT sonicate- induced JAK/STAT signalling pathway, KATO-III cells were treated with different doses of JAKI and then stimulated with H.pylori G27 WT sonicate for 24 h. According to Western Blotting results, STAT1 phosphorylation levels were decreased in the presence of JAKI in a dose –dependent manner of JAKI. Our results suggest that JAK/STAT signalling pathway plays a role in BAFF&APRIL expression and secretion in H.pylori G27 WT sonicate- treated KATO-III cells.