Ailesel Behçet Sendromu Ailelerinde Hla-b5 Geninin Genetik Ve Epigenetik Analizleri

Abstract

Behçet Sendromu, vücuttaki birçok doku ve sistemin iltihaplı tutulumuyla öne çıkan, kronik romatolojik bir hastalıktır. Başlıca belirtileri ağızda ve cinsel organda sıklıkla tekrar eden yaralar, vücutta sivilceler ve kızarıklıklardır. Bununla beraber, eklemlerde, dolaşım sisteminde, merkezi sinir sisteminde, gözün görme tabakasında, sindirim sistemininde ve akciğer, böbrek gibi organlarda iltihaplanma görülmektedir. Hastalık genellikle daha ağır bir seyirle 20’li ve 30’lu yaşlarda başlar. Behçet Sendromu’na, İpek Yolu olarak tanımlanan, Akdeniz ve Orta Doğu popülasyonlarının da üzerinde bulunduğu güzergahta sık rastlanmaktadır. Türkiye’de ise hastalığın sıklığının, 100.000’ de 20 ile 420 arasında değiştiği gösterilmiştir. Hastalık etkenleri, ailesel birikim ve Behçet Sendromlu ailelerde artan HLA-B51 sıklığı gibi indikasyonlar ile birlikte enfeksiyonel ajanlar, çevresel faktörler ve henüz tanımlanmamış immünolojik mekanizmalar olarak öne sürülmüştür. Bunların içinde HLA-B geninin bir alt aleli olan HLA-B51 aleli, bugüne kadar Behçet Sendromu ile ilişkilendirilmiş en önemli işaretlerden biridir. HLA-B geni 6. Kromozomun p(kısa) kolunda 21.3 ile tanımlanan bölgesinde bulunmaktadır.HLA-B, insan lökosit antijeni (HLA) denilen kompleks grubun başlıca genlerindendir. Görevi bağışıklık siteminde T hücrelerine antijen tanıtımını sağlamaktır. HLA-B geninin birden çok aleli bulunmaktadır. Bu alellerden Behçet Sendromu ile bağlantısı bilinen aleller HLA-B51, HLA-B15, HLA-B27 ve HLA-B57 olarak gösterilmiştir. Fakat bunların içinden HLA-B51 aleli günümüze kadar yapılan çalışmalarda, hastalık ile en çok bağlantılı bulunan alel olmuştur. HLA-B51 alelinin 89 dan fazla alt tip aleli bulunmaktadır. Günümüzde, HLA-B 51 alelinin HLA-B5101 ve HLA-B5108 gibi bazı alt alellerinin Behçet Sendromlu hastalarla bağlantısı olduğu gözlemlenmiştir. Genom genelinde yapılan bağlantı çalışmalarında, IL-10, IL-23R, IL-12A, MICA, STAT4 gibi farklı genlerinde Behçet Senromu ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Tüm bu bulgulara rağmen, HLA-B51 alelini taşıyan sağlıklı bireylerin varlığı, aynı şekilde HLA-B51 alelini taşımayan Behçet hastalarının varlığı, hastalığın oluşumunda başka mekanizmaların olabileceğini düşündürmüştür. DNA metilasyonu ve kromatin modifikasyonları gibi DNA dizisinde herhangi bir değişime sebep olmadan gen aktivitesini değiştiren epigenetik modifikasyonlar, tanımlanamayan kompleks hastalıkların nedenlerinin aydınlatılmasında önemli rol kazanmaktadır. Epigenetik modifikasyonlar içinde ise DNA metilasyonu en sık çalışılan regülasyon mekanizmalarından biridir. HLA-B geninde, 1346 nükleotit uzunluğundaki CpG adacığının varlığı ve bu bölgede CG dinükleotitlerinin %66.6 oranında yoğun olarak kümelendiği gözlemlenmiştir. CpG adacığında bulunan sitozin ve guanin bazlarının metillenmesi ile gen aktivitesinin dolayısıyla ekspresyonun değişmesi beklenmektedir. Yaptığımız öncül araştırmalarda, 4 monozigotik ve 4 dizigotik Behçet Sendrom’lu ikizlerin oluşturduğu çalışmamızda HLA-B geninin 1. ve 2. ekzonlarının epigenetik regülasyonunu düşündüren bulgulara rastladık. Bu çalışmada ise ailesel Behçet Sendromu vakaları ile birlikte ailelerinde bulunan diğer Behçet Sendrom’lu bireyler ve sağlıklı aile bireyleri de incelenmek istenmiştir. Bu sayede, HLA-B51 alelinin genetik ve epigenetik etkilerinin daha iyi anlaşılması planlanmıştır. 2013-2015 yılları arasında Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Romatoloji Polikliniği’ne tedavi olmaya gelen hastalar içerisinden irtibat kurulan yaklaşık 100 Behçet Sendrom’lu bireyden, ailesinde en az bir BS tanısı konulmuş akrabası bulunan 50 Behçet Sendrom’lu bireye ulaşılmıştır. İletişime geçilen 50 Behçet Sendrom’lu aileden 15 aile çalışmamıza katılmayı kabul etmiştir. Araştırma grubumuz toplamda 15 Behçet Sendrom’lu birey, ailelerindeki Behçet Sendrom’lu 17 akraba ve yine ailelerindeki 26 sağlıklı akrabalardan oluşmaktadır. Hastalardan ve ailelerinden alınan periferal kan örneklerindeki lökositlerden genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. Çalışma grubunda bulunan tüm bireyler, bölge spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu yöntemiyle HLA-B51 aleli için genotiplenmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda, HLA-B51 pozitifliği, indeks hasta grubu için 12/15, hasta akrabalar için 13/17 ve sağlıklı akrabalar için 22/26 olarak hesaplanmıştır. 25 kişiden oluşan aile dışı sağlıklı kontrollerde ise HLA-B51 pozitifliği 8/25 oranında bulunmuştur. HLA-B51 genotiplendirmesi sonrasında, HLA-B geninin 1.ekzon, 1.intron ve 2.ekzon bölgelerinin metilasyon seviyeleri Real-time PCR temelli OneStep qMethyl kiti kullanılarak analiz edilmiştir. HLA-B genine ait ekzon-1, intron-1 ve ekzon-2 bölgelerini içeren metilasyon analizlerinde, indeks hasta grubu ve ailelerindeki diğer Behçet Sendrom’lu ve sağlıklı bireyler arasında yapılan karşılaştırmada, tüm Behçet Sendrom’lu bireylerdeki metilasyon oranlarının sağlıklı akrabalarına göre anlamlı olarak yüksek olduğu görülmüştür (p=0.0065). Fakat tüm gruplar ayrı ayrı incelendiğinde, HLA-B51 taşıyıcılığının metilasyon seviyeleri üzerinde anlamlı bi fark yaratmadığı ortaya çıkmıştır. Elde ettiğimiz sonuçlar, Behçet ikizleriyle yaptığımız önceki çalışmamızın sonuçlarıyla tutarlı olarak bulunmuştur. Bu veriler ışığında, HLA-B51 alelinden bağımsız olarak muhtemel epigenetik mekanizmaların, hastalığın oluşumunda etkili olabileceği düşünülmüştür. Bu çalışmanın devamı niteliğinde, epigenetik mekanizmaların değişken olabildiği göz önünde bulundurularak, Behçet Sendrom’lu ailelelerdeki sağlıklı akrabalar, ortaya çıkabilecek çeşitli Behçet Sendromu benzeri bulgular açısından takip altında tutulmalıdır. Aynı şekilde HLA-B bölgesinde saptanmış DNA metilasyon farklılıklarının gen ekspresyonuna etkisinin görülmesi amacıyla, aynı bölge için gen ekpresyonu analizleri yapılmalıdır. Bu çalışmalara ek olarak, münferit Behçet vakalarında da aynı şekilde, HLA-B51 genotiplemesi ve HLA-B bölgesi için DNA metilasyon analizleri tekrarlanmalıdır. Bu sayede ailesel ve münferit vakalarda HLA-B51 sıklığı ve HLA-B genindeki DNA metilasyon farklılıkları gözlemlenebilir. Gelecekte yapılacak çalışmalar için, HLA-B51 aleline spesifik metilasyonun araştırılması, gen içerisinde ya da genler arasında etkili olabilecek faktörlerin anlaşılmasında yararlı olacaktır. Buna ek olarak, HLA-B5101 ve HLA-B5108 gibi alt alel farklılıkları, Behçet Sendrom’lu bireyler arasında saptanarak, alt alel değişimlerinin hastalık üzerindeki etkisi gösterilebilir.

Behçet’s Syndrome (BS) is a chronic multisystemic inflammatory disorder, primary symptoms of which are oral and genital ulceration and uveitis. The disease is also chracterized by inflammation in tissues and organs throughout the body such as vessels, lungs, kidneys, joints, gastrointestinal and central nervous system. BS usually occurs in second and third decades of the life with a severe disease course. It exists most commonly in Mediteranean and Middle East populations. In Turkey, frequency of the disease changes between 20 and 420 of 100.000. BS risk factors include genetic predisposition which is mainly based on familial aggregation and increased HLA-B51 carrier rate as well as infectious agents, environmental causes and yet undefined immunological mechanisms. Even though HLA-B51 allele has shown to be the most associated marker for BS, the presence of healthy individuals who carry HLA-B51 allele and similarly BS patients without HLA-B51 allele have led us question other mechanisms for BS causation. Epigenetic mechanisms have gained exceeding importance for their effects on DNA and chromatin structures without altering DNA sequence. DNA methylation is one of the mostly studied epigenetic mechanisms. HLA-B gene has shown to comprise a CpG island (CpGi) which span 1346 nucletides where CG ratio is 66.6 %, therefore methylation of cytosine residues may lead to a change in gene expression levels. We previously investigated global methylation and HLA-B locus specific methylation in a group of 4 MZ BS twins and 4 DZ BS twins; which suggested an involvement of an epigenetic regulation in HLA-B exon 1-2 region. BS twins had a higher methylation levels for HLA-B gene (p=0.0024). In this thesis we wanted to further our preliminary findings in familial BS cases and more directly examine the influence of HLA-B51 carrier rate and its methylation upon the presence of the clinical phenotype. Therefore, involvement of genetic and epigenetic roles of HLA-B51 region in BS would be better analysed and the sample size would be increased by including familial BS cases with their affected and unaffected relatives. 100 BS patients were contacted from Cerrahpaşa Medical Faculty, Rheumatology Polyclinic between 2013 and 2015 and asked if they have an affected relative. Within those 1800 index patients, 150 patients had a family member with BS. Among those, 15 families accepted to enroll in the study. So the study consists of 15 index patients; 17 affected relatives and 26 unaffected relatives. Peripheral blood samples were collected and genomic DNA was isolated from leukocytes. Patients and relatives were genotyped for HLA-B51 alleles using sequence specific PCR method. HLA-B51 positivity ratio was found to be 12/15 for index patients, 13/17 for affected relatives , 22/26 for unaffected relatives. Among BS and healthy family members, HLA-B51 frequency did not show a statistically significant diffrence. For healthy controls, who are not related with families, HLA-B51 positivity was 8/25. However, HLA-B51 positivity for BS patients was statistically higher when compared to healthy controls (p=0.0005). After determining HLA-B51 positivity, methylation profiles on HLA-B gene were analyzed and compared between groups using Real-time PCR based OneStep qMethyl Kit. For exon-1 and exon-2 region of HLA-B gene, BS patients had statistically higher methylation levels compared with healthy individuals in the family (p=0.0065). Methylation levels were not significantly different among HLA-B51(+) and HLA-B51(-) individuals for index patients, relatives with BS and healthy relatives. Observed results were also correlated with the data from our previous studies. These findings suggested us a room for epigenetic modifications which might be independent from HLA-B51 positivity.