Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11527/14533
Title: Ailesel Akdeniz Ateşi Hastalarında Histon Modifikasyonlarının Kromatin İmmünopresipitasyon Dizileme Kullanarak Analizi
Other Titles: Analysis Of Histone Modifications In Familial Mediterranean Fever Patients Using Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Assay
Authors: Turanlı, Eda Tahir
Fidan, Begüm
10077717
Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji
Molecular Biology and Genetics
Keywords: Ailesel Akdeniz Ateşi
MEFV
Epigenetik
Histon Modifikasyonu
Kromatin İmmünopresipitasyon
Familial Mediterranean Fever
MEFV
Epigenetic
Histone Modification
Chromatin Immunoprecipitation
Issue Date: 26-Jun-2015
Publisher: Fen Bilimleri Enstitüsü
Institute of Science And Technology
Abstract: Ailesel Akdeniz Ateşi (AAA) büyük çoğunlukla Türk, Ermeni, Yahudi ve Arap gibi Akdeniz kökenli toplumlarda görülen otoinflamatuar bir hastalıktır. Türkiye’de yaygınlığı 1:1000 ve yaygınlık frekansı 1:5’dir. AAA periton, plevra ya da sinovyum seröz membranlarından birinde oluşan inflamasyonun neden olduğu iltihap sonucu ortaya çıkan yüksek ateşle (38,5-40˚C) birlikte ciddi karın, göğüs ve eklem ağrılarının eşlik ettiği ani ve düzensiz ataklarla birlikte seyreder. Ataklar genellikle 1-3 gün boyunca sürer. Hastaların 70%’inde hastalık belirtileri ilk 10 yılda ortaya çıkar ve 90%’nında ise ilk 20 yılda hastalık başlangıç gösterir. Atak bölgeleri ve şiddeti bir hasta için farklılık gösterebileceği gibi her hasta için de farklı olabilmektedir. Klinik tanıda yüksek ateş, karın ağrısı, göğüs ağrısı ve hastanın Kolşisin ilacına verdiği cevap dikkate alınır. 1972 yılından beri hastalığın tedavisinde kolşisin ilacı kullanılır. Tedavi düzenli ve uzun süreli olmalıdır. Hastaların 90%’nında yeterli dozda ve düzenli olarak kullanıldığında atakların tamamen düzeldiği, 30%’unda ise atakların şiddeti ve sıklığının azaldığı, 5%’inde ise bu ilaca yanıt vermediği gözlenmiştir. Kolşisin tedavisine cevap vermeyen hastalarda amiloidoz birikimi riski çok yüksektir. Amiloidoz, başta böbrek olmak üzere diğer organlarda fonksiyon bozukluğu veya yetersizliğe yol açan suda erimeyen bir proteinin gelişimiyle ortaya çıkan bir hastalıktır. Klinik tanıda idrar testlerinin yapılması amiloidoz varlığının tespitinde önemli yer tutar. Hastalığa kesin tanı koyacak bir laboratuar testi yoktur. Atak döneminde bazı laboratuar bulguları anormal olarak tespit edilebilir ancak hiç biri tanı koymaya yeterli değildir. AAA’nde görülen klinik bulgular pek çok hastalıkta da görülebildiği için hastalığın tanısı çoğu zaman gecikebilmektedir. Aile geçmişinde AAA hastalığı olan, klinik bulguları ve etnik yapısı uygun olan kişilerde tanının kesinleşmesi için genetik test yapılabilir. Ancak unutulmamalıdır ki genetik testi pozitif olanların hepsi AAA olmadığı gibi, negatif olanlar da AAA olabilir. AAA otozomal resesif (çekinik) geçiş gösteren kalıtsal bir hastalıktır. Yani hastalığın ortaya çıkması için anne ve/veya babanın bu hastalık genlerini taşıması gerekir. Stres, enfeksiyon, aşırı fiziksel egzersiz, yorgunluk, travma gibi tetikleyici çevresel etkenlerin dışında MEFV geninde meydana gelen mutasyonlar AAA’ne yol açar. MEFV geni 1992’de haritalanmış ve 1997’de ise klonlanmıştır. MEFV 16. kromozomun kısa kolu üzerinde (16p13.3 noktasında) yerleşim gösterir ve 10 ekzondan oluşur. MEFV geni 781 amino asitten oluşur ve pyrin/marenostrin adı verilen bir proteini kodlamaktadır. Bu proteinin fonksiyonu tam olarak bilinmemekle birlikte inflamasyon kontrolünde rol oynadığı ve özellikle nötrofillerde ifade olduğu ileri sürülmektedir. Şimdiye kadar MEFV geni üzerinde büyük çoğunluğunu yanlış anlamlı (missense) mutasyonların oluşturduğu amino asit dizisinde değişikliğe yol açan ve proteinin yapısını ve fonksiyonunu bozan 200’den fazla mutasyon/varyasyon tespit edilmiştir. Bu mutasyonlardan en sık görülen 5 tanesi M694V, M694I, M680I, E148Q, V726A’dır ve ekzon 2 ve ekzon 10 üzerinde meydana gelirler. MEFV mutasyonların çoğu 10. ekzon üzerinde birikmiştir ve pyrin proteinin PRYSPRY alanı tarafından kodlanmaktadırlar. Bunun dışında çoğu nadir görülen mutasyonlar 2. ve 5. ekzonlarda yoğunlaşmışlardır ve pyrin proteini’nin bu mutasyonlar üzerine etkisi henüz bilinmemektedir. MEFV geni 3700 baz çiftlik (bç) bir mRNA kodlamaktadır. Bu gen genellikle nötrofiller, eozinofiller, sitokin aktive monositler, dendritik hücreler ve sinovyal fibroblastlarda ifade edilir fakat lenfositlerde ifade edilmez. FMF hastalarının atak döneminde polimorfik nükleer hücrelerde anormal trafik ve ataksız döneminde MEFV mRNA ifadesinin periferik kandaki löksitlerde azaldığı tespit edilmiştir. MEFV mRNA çoğunlukla 2., 3., 4. ve 8. ekzonu içeren alternatif birleşmeye maruz kalmaktadır. En az 16 tane farklı mRNA formu tespit edilmiştir: tam boy, MEFV-d2 (2 Δ), ekzon 2a (2a), ekzon 4a (4a), ekzon 8ext (8ext), Δ2/4a, 2a/4a, Δ2/8ext, 2a/8ext, del234, del2345, del34, del7, del78, 9ext and 2Δ /9ext. MEFV geninin tam boy kopyası olan pyrin proteini sitoplazmik bölgede yerleşim gösterirken, 2. ekzonu içermeyen alternatif kopyasının ise nükleusta yerleşim gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca bu formun AAA hastalarında sağlıklı gruba oranla daha çok kodlandığını daha önceki çalışmalarımızda gösterilmiştir. MEFV genindeki genetik değişikliklerin yanı sıra pek çok epigenetik olay AAA hastalığının ortaya çıkmasında rol oynamaktadır. Epigenetik, DNA dizisi üzerinde bir değişiklikle meydana gelmeden ancak gen ifadesinde değişikliğe yol açan yani kalıtsal olan fenotipik değişiklikleri inceler. 3 temel epigenetik mekanızma; DNA metilasyonu, histon modifikasyonları ve RNA alternatif kırpılmalarıdır. Epigenetik mekanizmalar gen ifadesini dolaylı veya doğrudan etkilemesine bağlı olarak ikiye ayrılır. Post-translasyonel yani DNA’nın mRNA’yı kodladıktan sonra meydana gelen değişiklikler gen ifadesini dolaylı olarak etkilerler. DNA ve kromatin boyutundaki modifikasyonlar ise doğrudan gen ifadesini etkilerler.  DNA düzeyindeki en bilinen modifikasyon DNA metilasyonudur ve DNA-protein etkilşimini yöneterek gen ekspresyonunu kontrol eder. DNA metilasyonu genellikle sitozin ve guanin bazlarından zengin olan ve CpG adacığı olarak adlandırılan bölgede, sitozin bazının 5. karbonu üzerine metil grubunun bağlanması ile meydana gelir. DNA metillenmesinde S-adenozil metiyonin (SAM) metil donörü olarak işlev görür ve DNA metiltransferaz enzimi reaksiyonu katalizler. Metillenen DNA sıkı bir yapılanma gösterirken (heterokromatin), metillenmemiş bölgeler daha serbest bir şekilde (ökromatin) paketlenirler. Laboratuar grubumuz daha önceki çalışmalarda MEFV geninin 2. ekzonu üzerindeki DNA metilasyonun AAA hastalarında sağlıklılara oranla daha yüksek olduğunu tayin etmiş (p=0.049) ve böylece DNA metilasyonu ile AAA ile ilişkisini göstermişlerdir. Kromatin boyutundaki modifikasyonlar kovalent ve nonkovalent olmak üzere ikiye ayrılırlar. Kovalent modifikasyonlar histon modifikasyonlarıdır. DNA, histon proteinler, diğer proteinler ve RNA ile birlikte paketlenerek kromatin ipliğini oluşturur. Yaklaşık 147 baz uzunluğundaki negatif yüklü DNA pozitif yüklü histon proteinlerine bağlanmak ve etrafında 2 defa dönmek suretiyle histon oktomerine (H2A, H2B, H3 ve H4 proteinlerinin ikişer kopyasından oluşur) bağlanır ve kromatinin temel yapısı olan nükleozomu oluşturur. DNA histon proteinlerine bağlanarak açık (ökromatin) veya kapalı (heterokromatin) bölgeleri oluşturur. Post-translasyonel histon modifikasyonları gen ifadesini etkileyen önemli epigenetik bir mekanizmadır. Histon kuyruklarının amino uçları lizin rezidülerinin asetilasyonu, metilasyonu, fosforilasyonu, übikitinasyon, sümoylasyonu, arjinin rezidüleri metilasyonu, serin ve treonin rezidülerinin fosforilasyonu gibi çok sayıda modifikasyona maruz kalır. Tersinir post-translasyonel histon modifikasyonları histon-histon ve histon-DNA etkileşimini dolayısıyla kromatin yapısını ve o geni açık veya kapalı duruma getirerek gen ekspresyonunun gerçekleşip gerçekleşmeyeceğini belirlerler. Histon kuyruğuna asetil grubunun bağlanmasıyla DNA serbest yapıya ulaşır ve gen ifadesi gerçekleşir. Asetil grubunun bağlanmasından histon asetil transferaz (HAT), ayrılmasında ise histon deasetil transferaz (HDAT) enzimi sorumludur. Diğer bir post-translasyonel modifikasyon olan histon metilasyonu yerleşimine bağlı olarak aktif veya pasif kromatinin belirleyicisi olabilir. Histon metilasyonu, histon proteinlerinde bulunan amino asitlere (lizin, arjinin, serin, treonin) histon metil transferaz (HMT) enzimleri tarafından 1, 2 veya 3 metil grubunun eklenmesiyle meydana gelir. Histon lizin metilasyonu aktif transkripsiyon ile ilişkili olabileceği gibi (örneğin Histone H3 lizin 4 (H3K4), Histone H3 lizin 36 (H3K36)), pasif transkripsiyon  ile de (örneğin Histone H3 lizin 9 (H3K9), Histone H3 lizin 27 (H3K27)) ilişkili olabilir. H3K9me3 histon modifikasyonu genellikle gen susturulmasında rol oynar ve heterokromatin bölge ile ilişkilidir. H3K4me3 modifikasyonu ise aktif gen bölgelerini temsil eder ve ökromatin ile ilişkilidir. Tüm genom boyu yapılan çalışmalar H3K4me3 modifikasyonunun genellikle CpG adacığının yer aldığı promoter ve transkripsiyon başlangıç bölgesinde bulunduğunu ifade etmektedir. İki önemli epigenetik mekanizmanın, DNA metilasyonu ve kromatin modifikasyonu, birbirlerinden tamamen bağımsız olmadığı yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Bu çalışmanın odak noktası AAA hastalarında H3K9me3 ve H3K4me3 modifikasyonlarının tüm genom boyunca dağılımlarının yanı sıra MEFV geni üzerindeki DNA metilasyonu ve inflamasyon ile ilişkilerini analiz etmektir. 10 AAA hastasının atak ve ataksız dönemlerinde (4 kadın, 6 erkek) ve 10 sağlıklı (5 kadın, 5 erkek) bireylerinden elde edilen periferik tek nükleuslu hücreler ile hedef proteine spresifik antikorlar kullanılarak kromatin immünopresipitasyon (ChIP) analizini takiben polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile ChIP doğrulandı ve yeni nesil dizileme ile birleştirildi. Metillenmiş H3K9(me3) ve H3K4(me3)’ün genom boyunca dağılımları dizileme sonuçları kullanılarak biyoinformatik analiz ile değerlendirildi.  Öncelikle tüm bireylerden MEFV ekspresyonun var olduğu periferik kan tek nükleuslu hücreler yoğunluk farkı methodu ile izole edilmiştir. Formaldehit ile proteinler DNA’ya bağlanmış ve glisin solüsyonu ile bağlanma işlemi sonlandırılmıştır. PBS çözeltisi ile yıkanan hücreler formaldehitten uzaklaştırıldıktan sonra liziz buffer ile hücreler patlatılmış ve içeriği ortaya çıkartılmıştır. Sonikasyon ile proteinlere zarar vermeden kromatinler ortalamaları 500 baz olmak üzere 200 -700 baz aralığında küçük parçalara ayrılmıştır. İmmünopresipitasyon aşamasında hedef modifikasyonlara spesifik antikorlar öncelikle manyetik boncuklara bağlanmış ve daha sonra elde edilen kompleks hücre lizatı ile inkübe edilerek immün kompleks oluşturulmuştur. Hücre lizatının bir kısmı input olarak daha sonraki aşamalarda kullanılmak üzere saklanmıştır. Seri yıkamaların ardından immün kompleks ve input kontrol yüksek sıcaklığa maruz bırakılarak protein/DNA çapraz bağları tersine çevrilmiş ve protein, RNA gibi içerikler uzaklaştırıldıktan sonra saf DNA izole edilmiştir. Elde edilen DNA modifikasyonlara spesifik antikorların bağlandığı bölgeleri temsil etmektedir ve analizleri için kromatin immünopresipitasyon yeni nesil dizileme ile birleştirilmiştir. Dizileme sonucu elde edilen 50 bazlık kısa okumalar referans genoma (hg19) haritalanmış ve okumaların yarısından fazlasının genomun tek bir bölgesi ile spesifik olarak eşleştiği tespit edilmiştir. Okumaların yoğunlaştığı bölgeler pikler ile hizalanmış ve bu aşamada kontrol olarak input kullanılmıştır (Mfold=32). Bu piklerin temsil ettiği genler tespit edilmiş ve yerleşimleri görüntülenmiştir. Biyoinformatik analiz, tüm çalışma gruplarında inaktif transkripsiyonu temsil eden H3K9me3 modifikasyonunun genom boyunca dağılımının aktif transkripsiyonu temsil eden H3K4me3 modifikasyonundan yaklaşık 10 kat daha az olduğunu yansıtmaktadır. H3K4me3 modifikasyonlarının coğunlukla genin düzenleyici bölgelerinde ve H3K9me3 modifikasyonlarının ise intragenik bölgelerde yerleştikleri tespit edilmiştir. Ayrıca, her iki modifikasyona ait okumaların tüm çalışma grubuna ait örneklerde MEFV geni ile eşleştiği tespit edilirken H3K4me3 modifikasyonuna ait okumaların atak dönemdeki AAA hastalarında MEFV genin promoter, 1. ekzon ve 1. intron’un bir kısmını kapsayan bölgesinde  ataksız dönemdeki AAA hastaları ve sağlıklı kontrollere göre çok daha fazla yoğunlaştığı tespit edilmiştir. Bunun yanında H3K4me3 modifikasyonunun otoinflamasyonda rol oynayan ve pyrin proteini ile ilişkili bazı genlerin çoğunlukla promoter bölgelerinde ataklı AAA hastalarında, sağlıklı ve ataksız AAA hastalarından daha fazla bulunduğu tespit edilmiştir. Biyoinformatik analiz sonucu PZR kullanılarak MEFV geninde tespit edilen pik bölgesini çoğaltan 2 ayrı PZR ve GAPDH pozitif kontrol primerleri kullanılarak doğrulanmıştır. Bu sonuç H3K4me3 modifikasyonunun AAA hastalarında DNA metilasyonu ve inflamasyon ile ilişkisi olabileceğini düşündürmektedir.  Gelecekte yapılacak çalışmalarda istatistiksel analiz ve ChIP doğrulaması için daha kontrol ve hasta gruplarına ait fazla sayıda örnek kullanılmalıdır. ChIP-Seq sonucu belirlenen aday gen bölgeleri qPCR ile doğrulanmalıdır. Yeni nesil dizilemeden daha fazla okuma sayısı elde edebilmek için, dizileme tekrarlanmalı ve böylece histon modifikasyonlarının tüm genom boyunca dağılımları daha derinlemesine incelenmiş olacaktır. ChIP, ilişkili olabilecek diğer histon modifikasyonlarına spesifik antikorlar ile tekrarlanmalı ve DNA metilasyonu, alternatif kırpılmış formların analiz çalışmaları ile birleştirilmelidir. Böylece AAA hastalığının patolojisinin ve epigenetik mekanizması daha derinlemesine anlaşılabilmesine yardımcı olacaktır.
Familial Mediterranean Fever (FMF) is mainly an autosomal recessive inherited disease affects mostly Jewish, Arab, Turk and Armenian populations and characterized by irregular inflammatory attacks of fever. FMF responsible gene is MEFV which localizes on short arm of chromosome 16 and consists of 10 exons that comprise a 3,7 kb transcript. The protein encoded by MEFV is Pyrin/Marenostrin (P/M) that 781 amino acid protein, 86 kd moleculer weight and localizes in cytoplasm. More than 200 mutations/variations were detected in MEFV gene which mostly localize on exon 2 and exon 10 until now. The most common five of these mutations are M694V, M694I, V726A, M680I and E148Q. While 80% of FMF patients carry mutation in MEFV, 15-20% of patients carry no mutations in the gene.  Our previous studies showed a possibility of epigenetic regulation in this disease development, based on finding of increased exon methylation at exon 2 (p=0.049), reduced gene expression and increased exon 2 deleted transcript splice form of MEFV gene (p=0.026) compared to healthy controls. Epigenetics is the study of changes in gene expression wtihout changes in deoksiribonucleic acid (DNA) sequence. These changes are controlled by three major mechanisms which are DNA methylation, histone modifications and RNA associated silencing. DNA methylation and histone modifications do not act independently from each other. DNA is packaged by histone proteins, other proteins and RNA into chromatin. Nucleosome that is the basic unit of chromatin, consist of ~147 bp of DNA tightly wrapped around the histone octamer which include two copies of H2A, H2B, H3, and H4 proteins. Through post-translational modifications of histone tails mostly, chromatin structure can be either condensed or open. These modifications are potentially reversible and heritable. Post-translational modifications of N-terminal of histones include acetylation, methylation, ubiquitylation and sumoylation of lysine residues, methylation of arginine residues, phosphorylation of serine and threonine residues. Histone lysine methylations can be associated with transcriptional activation, such as trimethylations of Histone 3 lysine 4 (H3K4me3) and repression, such as trimethylations of Histone 3 lysine 9 (H3K9me3), commonly referred to as euchromatin and heterochromatin modifications, respectively. The reversible modifications of histones affect the histone-histone and histone-DNA interactions and thus regulate the chromosome structure and gene expression. In the light of all, we were performed chromatin immunoprecpitation (ChIP) followed by qPCR confirmation and high throughput sequencing (ChIP-Seq) for genome wide analysis of variations in methylated histones (H3K9me3 and H3K4me3) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from 10 FMF patients during attack period, the same 10 FMF patients during attack-free period and 10 healthy subjects to assess whether the modifications are related to inflammation and analyse the chromatin dynamics of FMF patients. ChIP-Seq data was generated (177,447,268 bases) from Illimuna HiSeq 2500 and examined with bioinformatic analysis. Firstly, ChIP-Seq data were converted to fastqsanger format and uniquely aligned to reference genome (human, hg19) after quality control. Then, significantly enriched regions were detected by peak callers which are MACS and SICER (FDR
Description: Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2015
URI: http://hdl.handle.net/11527/14533
Appears in Collections:Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Yüksek Lisans

Files in This Item:
There are no files associated with this item.


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.