Hastalıkla İlişkili Proteinlerin İzlenmesinde Anorganik Peptit Bağlarla Füzyon Biyomoleküllerin Tasarımı

Abstract

Hastalıklarla ilişki antijenlerin belirlenebilmesi hayat kurtarır. Bu nedenle araştırmacılar sürekli olarak daha hassas ve hızlı tanı sistemleri geliştirmek için çalışmaktadırlar. İlk olarak, ELISA yöntemi gibi tanı sistemlerinde standart olarak kullanılan kolorimetrik substratlar daha hassas ve hızlı görüntüleme sağlayan kemilüminesan subtratlar ile değiştirilmeye başlanmıştır. Bazı çalışmalar ise tanı sistemlerindeki aşamaların azaltılması konusuna yönelmiştir. Algılayıcı moleküller olan antikorlara kovalent olarak bağlanmış kuantum dot’lar gibi floresan moleküller veya genetik füzyon olarak bağlanmış yeşil floresans protein (GFP) aracılığıyla tek aşamalı tanı sistemleri geliştirilmiştir. Günümüzde ise farklı tanı stratejilerin ile yeni cihazların geliştirilmesi söz konusu olmaktadır. Yüzey plazmon rezonans (SPR) spektrometreleri protein-protein etkileşimlerini gerçek zamanda takip etmeyi sağlayan cihazlardır. Bu cihazlar sayesinde protein-protein etkileşimlerinin kinetik hesaplamalarının yapılması dışında ayrıca daha kesin sonuçlar elde edilmesini sağlanmaktadır. SPR cihazların temeli SPR çipi yüzeyinde bulanan ince altın tabakasının yaydığı yüzey plazmon rezonanslarına dayanmaktadır. SPR çipinin alt tarafında bulunan bir prizmanın içerisinden geçen bir ışık süzmesi gönderilmektedir. Işık süzmesinin altın tabakaya çarptıktan sonra ışık süzmesinin yansıma açısı ölçülmektedir. SPR çipi üzerinde proteinlerin geçişi sağlandığı zaman çip yüzeyine bağlanan proteinler altın tabakanın yaydığı yüzey plazmon rezonansını etkileyerek ışık süzmesinin yansıma açısını değiştirmektedir. Ölçülen yansıma açısındaki değişiklik çip yüzeyinde bağlanan protein miktarı ile doğru orantıda olmasından dolayı çip yüzeyinde etkileşime giren protein miktarı belirlenebilmektedir. Protein-protein etkileşimleri, SPR çipi yüzeyinde oluşan yüzey plazmon rezonans değişimine dayalı olması nedeniyle diğer tanı sistemlerinde gereken enzim veya floresans molekül gibi işaretleyici moleküller ihtiyaç duyulmaması SPR’a dayalı tanı sistemlerinin en büyük avantajıdır. SPR temelli tanı sistemleri umut vaat edici olmalarına karşın birkaç dezavantajları bulunmaktadır. Protein-protein etkileşimlerinin incelenebilmesi için öncelikle bir proteinin altın kaplı çip yüzeyine bağlanması gerekmektedir. Bu bağlama işlemi, öncelikle çip yüzeyinde bulunan altın tabakasının kullanım türüne göre farklı kimyasal kaplama molekülleri ile protein bağlaması için aktif hale getirilmesi gerekmektedir. Daha sonra da proteinlerin amino veya karboksi gruplarından bağlamak için ayrıca kimyasal reaksiyonlar gerekmektedir. Uygulanan bu kimyasal reaksiyonların bağlanacak proteinler üzerinde olumsuz etki gösterebileceği göz ardı edilemez. Diğer dezavantaj ise ELISA için de geçerli olmakla birlikte çip yüzeyine bağlanan proteinlerin yönlendirilmemiş olmasıdır. Bu nedenle bazı proteinlerin diğer proteinlere bağlanma bölgeleri, oluşturulan bağ nedenliyle perdelenmiş olur ve hedef molekülün tanısında veri kaybına neden olabilmektedir. Bu çalışma, kimyasal reaksiyonlar kullanmadan ve kendilerini yönlendirmiş bir şekilde SPR çipi yüzeyine bağlayabilen antikor yapıların geliştirilmesine odaklanarak SPR’a dayalı tanı sistemlerinde bir iyileştirilmeye gidilmesini hedeflemektedir. Hastalıklarla ilişkili proteinlerin takibinin yapılması için tasarlanacak sistem için model olarak Hepatit B virüsü yüzey antijenine bağlama özelliği olan bir rekombinant bir antikor kullanılacaktır. Hepatit B virüsü (HBV), Kronik Hepatit, siroz ve karaciğer kanserinin (hepatoselüler karsinoma, HCC) başlıca sebeplerindendir. Dünya sağlık örgütüne göre yaklaşık 2 milyar kişi HBV tarafından enfekte edilmiş ve enfekte edilen kişilerden 240 milyonunun enfeksiyonu kronikleşmiş durumdadır. Her yıl yaklaşık 600.000 kişi HBV’ye dayalı hastalıklardan hayatını kaybetmektedir. HBV, insan hepatositlerini enfekte ederek enfeksiyöz virionların ve yoğun miktarda hepatit B yüzey S antijeninin (HBsAg) kan dolaşım sistemine bırakılmasına neden olmaktadır. Bu nedenle dolaşım sisteminde HBsAg’nin varlığı HBV enfeksiyonu belirtecidir. HBV enfeksiyonu rutin olarak HBsAg’ye spesifik ELISA kitleri ile belirlenmektedir. Bu kitler dünya çapında yaygın olarak kullanılmaktadır. Fakat, bu kitler kullanılarak HBsAg varlığı ancak 3 saat gibi bir sürede tespit edilebilmektedir. Daha da önemlisi bu tür tanı sistemlerinde algılayıcı bir anti-HBsAg dışında bir de işaretleme için farklı bir anti-HBsAg antikoru gerekmektedir. Bu sebepten dolayı kitlerin maliyetini artırmaktadır. Bu nedenlerden dolayı oluşturulmak istenen yeni SPR temelli biyosensör stratejisi için HBV enfeksiyonu tanısı model olarak seçilmiştir. Bu kapsamda, öncelikle HBsAg’ye bağlanma özelliği olan rekombinant antikor geliştirmek amacıyla Faj gösterim teknolojisi kullanılmıştır. Faj gösterim teknolojisi ile rekombinant antikor geliştirmek için standart olarak deney farelerinin saf hedef antijen ile bağışıklanması gerekmektedir. Bu çalışmada ise, ilk yenilikçi yaklaşım olarak maliyeti yüksek olabilecek saf antijenlerin kullanılmasından ziyade bağışıklamalar için yüzeyinde HBsAg’yi sunan bakteriyofajlar kullanarak farelerin bağışıklanmasını sağlamak olmuştur. Fajların, hayvan bağışıklama çalışmalarında adjüvan olarak kullanıldığı bilinmektedir. TÜBİTAK Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulundan onay alındıktan sonra Hepatit B yüzey antijeni geni polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmış ve bir fajmit vektöre klonlanmıştır. Sonrasında E. coli TG1 suşuna rekombinant vektör kimyasal transformasyon ile aktarılmıştır. Daha sonra HBsAg’nin faj yüzeyinde expresyonu sağlanmış ve bu fajlar fare bağışıklamasında kullanılmıştır. Ardı ardına yüzeyinde HBsAg sunan fajlar ile yapılan üç enjeksiyon sonrasında farelerin oluşturduğu anti-HBsAg immün yanıta ELISA (Enzyme-linked immunosorbant assay) yöntemi ile bakılmıştır. Yapılan enjeksiyonlar sonucunda farelerde immün yanıt oluştuğu gösterilmiştir. Bu çalışmalar Uluslararası atıf endeksine giren “Advances in Biosciences and Biotechnology” dergisinde yayınlanmıştır. Bağışıklama sürecinden sonra immün yanıt gösteren farelerin dalağı alınmış ve antikor üreten B lenfositlerinden RNA izolasyonu yapılmıştır. RNA’ların cDNA’ya çevrilmesiyle bir cDNA kütüphanesi oluşturulmuştur. PZR yöntemi ile cDNA kütüphanesinden antikor ağır ve hafif değişken bölgeleri çoğaltılmış ve tek zincir rekombinant antikor (single chain variable fragment, scFv) gen kütüphanesi oluşturulmuştur. Elde edilen kütüphane fajmit vektöre klonlanmış ve E. coli TG1 bakterilerine kimyasal transformasyon ile aktarılmıştır. Daha sonra yüzeylerinde antikor kütüphanesi sunan fajlar elde edilmiş ve bu kütüphane HBsAg’ye karşı taranmıştır (Biopanning). HBsAg’ye bağlanan fajlar seçilmiş ve tekrar bir biopanning aşamasından geçilerek kütüphanesinin zenginleşmesi sağlanmıştır. Üç zenginleştirme aşamasından sonra faj klonlarının ayrı ayrı HBsAg’ye bağlanmaları ELISA ile kontrol edilmiştir. HBsAg’ye bağlanma özelliği olan antikorlar seçilmiş olmasına karşın TÜBİTAK Marmara Araştırma Merkezi Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Enstitüsü immünogenetik Laboratuarında daha önceden oluşturduğumuz Lig7 anti-HBsAg rekombinant antikoru kadar iyi bağlanma göstermediklerinden biyosensör çalışmalarına Lig7 antikoru ile devam edilmesine karar verilmiştir. Lig7 antikoru PZR ile çoğaltıldıktan sonra pQE2 bakteriyel ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Bu ekspresyon vektörünün özelliği, protein saflaştırma çalışmalarında kolaylık sağlayan Histidin kuyruğunun (His-Tag) daha sonra Histidin kuyruğu ile protein arasına yerleştirilmiş proteaz kesim bölgesi sayesinde Histidin kuyruğunun çıkarılabilmesidir. Bu sayede üretilen proteinin orijinal yapısına en yakın olabilecek şekli elde edilebilmektedir. Lig7 geni pQE2 vektörüne klonlandıktan sonra genetik füzyon olacak şekilde Prof. Dr. Candan TAMERLER ve grubunun (Moleküler Biyoloji- Genetik ve Biyoteknoloji Araştırma Merkezi, İstanbul Teknik Üniversitesi) karakterize etmiş olduğu altına bağlanma özelliği olan GBP1’yi (Gold Binding Peptide-1) kodlayan gen rekombinant vektöre klonlanmıştır. Klonlamalar sonrasında genetik füzyon yapı DNA dizi analizi ile kontrol edilmiş ve üç farklı füzyon yapı belirlenmiştir. Bu genetik füzyonların, Lig7 ile birleşmiş farklı GBP1 tekrarlarından (tek GBP1, 3’lü tekrar ve 5’li tekrar) olduğu tespit edilmiştir. Lig7 antikoru ile üç Lig7 GBP1 füzyon yapıları eksprese edilmiş ve His-tag aracılığı ile saflaştırılmıştır. Saflaştırılan altına bağlanma özelliği kazandırılmış anti-HBsAg bifonksiyonel rekombinant antikorların altın kaplı SPR çiplerine bağlanmaları Reichert SPR spektrometresiyle kontrol edilmiş ve bağlanmaları teyit edilmiştir. Daha sonra, çip yüzeyine yönlendirilmiş şekilde bağlanmış bifonksiyonel antikorların HBsAg’yi bağlama özellikleri yine SPR spektrometresiyle kontrol edilmiş ve HBsAg’nin çip yüzeyine tutulduğu gösterilmiştir. SPR spektrometresi ile yapılan kinetic çalışmalar sonucunda Lig7-GBP1, Lig7-3GBP ve Lig7-5GBP füzyon antikorlarının altına bağlanma kinetiği çok farklılık göstermemesine karşın GBP1 tekrar sayısının HBsAg’nin bağlanması açısından kayda değer farklılıklar gösterdiği tespit edilmiştir. Füzyon antikor yapılarının HBsAg için denge ayrışma sabitleri Lig7-GBP1, Lig7-GBP3 ve Lig7-5GBP için sırasıyla 315 nM, 30 nM ve 0,6 nM olarak belirlenmiştir. Bu değerlere bakıldığında GBP1 tekrarının artmasıyla antikorun HBsAg’ye olan “afinitesinin” arttığı görülmüştür. Ancak anti-HBsAg Lig7 antikoru her bir füzyon yapı için aynı olduğundan bağlanmadaki bu farkın antikorun HBsAg’nin bağlanmasına ne kadar elverişli olduğunun bir göstergesi olarak kabul edilmiştir. Bu nedenle altın çip yüzeyine yönlendirilmiş şekilde adsorbe edilmiş Lig7-5GBP bifonksiyonel antikorun konformasyonel olarak diğer iki antikora göre HBsAg’yi bağlamak için daha uygun olduğu görülmüştür. Antikorların altına bağlanma kinetiklerinin yaklaşık aynı olduğu düşünülürse tekrar sayınının altına bağlanma özelliğini arttırmasından çok, anti-HBsAg Lig7 antikorunun uygun konformasyonda sunulmasında etkili olduğu gözlemlenmiştir. Kimyasal bağlar oluşturarak SPR çipi üzerine bağlanmış Lig7’nin HBsAg’yi bağlama denge ayrışma sabitinin 31,4 nM olduğu hesaplanmıştır. Bu değerin, Lig7-3GBP’nin HBsAg için olan denge ayrışma sabiti ile yaklaşık aynı olduğu, Lig7-GBP ile karşılaştırıldığında ise daha düşük olduğu görülmüştür. Fakat Lig7-5GBP’nin HBsAg’ye olan afinitesinin kimyasal olarak bağlanmış Lig7’den de yaklaşık 50 kat daha iyi olduğu görülmüştür. Bu sonuçlar da, tez çalışmalarının dayandığı, bifonksiyonel rekombinant antikorların yönlendirilmiş şekilde altın kaplı SPR çiplerinin üzerine kaplanarak SPR sistemlerinde biyosensör uygulamalarının iyileştirilmesi hipotezinin doğruluğunu göstermiştir. Sonuç olarak bu çalışmada, genetik olarak altına bağlanma özelliği kazandırılmış bir rekombinant antikorun yönlendirilmiş bir şekilde altın kaplı SPR Çipleri yüzeyine bağlandığı gösterilmiş, ve bu antikorun SPR spektrometresine dayalı tanı sistemlerinde kullanılabileceği ve hatta bir iyileştirme sağladığı gösterilmiştir.

DESIGN OF INORGANIC PEPTIDE BONDED FUSION BIOMOLECULES FOR TRACKING DISEASE RELATED PROTEINS