Bacıllus Subtılıs’te Bacılysın Biyosentezi İle İlgili Yeni Genlerin Tn-10 Transpozon Mutajenez Metodu İle Tanımlanması

Abstract

Bacillus türleri antimetabolik ve farmakolojik aktiviteye sahip çeşitli ikincil metabolitler üretirler. Bunların çoğu, peptid sentetaz isimli enzim kompleksleri tarafından ribozomal olmayan biçimde sentezlenirler. Bacillus subtilis suşları tarafından sentezlenen bacilysin L-alanin ve L-anticapsin’den oluşmuş dipeptiddir. Bacilysin biyosentezinin, ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ComA’ nın etkisinde quorum sensing kontrolünde olduğu ve Spo0K (Opp)’ ye bağlı biçimde gerçekleştiği gösterilmiştir. Aynı çalışmada, srfA operonunun doğrudan bacilysin üretimi ile ilgili olduğu, bacilysin üretiminden sorumlu genlerin abrB gen ürünün negatif kontrolünde olduğu ve SpoOA proteini ile desteklendiğini gösterilmiştir. B. subtilis 168’in ywfBCDEF genlerinin bacilysin biyosentetik fonksiyonlar taşıdığı gösterilmiş ve bacABCDE olarak adlandırılmıştır. bacD geninin amino asid ligasyonundan sorumlu bacilysin sentetaz olduğu doğrulanmıştır. Bu çalışmada, bacilysin biyosentezi ile ilgili yeni genlerin aydınlatılması üzerine yoğunlaşılmıştır. Bu amaçla, Transpozon mutajenez metodu uygulanmış, bloke mutantlar, transpozon kütüphanesinden biyoassay ile seçilmiş ve üç bacilysin üretemeyen mutant izole edilmiştir. B. subtilis genomunda henüz kimse tarafından tanımlanmamış bir gen olan yvfI geninin (bilinmeyen: transkripsiyonel düzenleyicilere benzer) biyosentezle ilgisini ortaya çıkarmamızla sonuçlanmıştır. Bunu takiben, yvfI geninin bacilysin biyosentezindeki rolünün doğrulanması amacıyla, B.subtilis PY79’da yvfI genini bloke edecek delesyon vektörü oluşturulmuştur. (yvfI::spc) mutasyonunun PY79’a uygulanması bacilysin biyosentezinin eliminasyonuyla sonuçlanmıştır.The members of the species Bacillus produce a wide variety of secondary metabolites with antimetabolic and pharmacological activities. These are small peptides that are synthesized nonribosomally by enzyme complexes called peptide synthetases. Bacilysin, being produced by certain strains of Bacillus subtilis, is a dipeptide antibiotic composed of L-alanine and L-anticapsin. Biosynthesis of bacilysin is under the quorum sensing regulation through the action of ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ComA in a Spo0K (Opp)-dependent manner in B. subtilis. The srfA operon functions directly in the production of bacilysin and gene(s) involved in bacilysin formation is under negative control of abrB gene product which is relieved by Spo0A protein. ywfBCDEF genes of B. subtilis 168 were shown to carry biosynthetic core function and renamed as bacABCDE. bacD gene was proved to encode the function of amino acid ligation. In this present study, we focused on identification of new gene(s) involved in the biosynthesis of bacilysin. For this purpose, Transposon mutagenesis was employed to disrupt such genes related with bacilysin biosynthesis. Blocked mutants were selected from transposon library through bioassay and three bacilysin nonproducer mutants were selected. The disrupted gene(s) from these mutants were cloned and sequenced. This study resulted with the identification of a novel gene yvfI (unknown, similar to transcriptional regulator) involved in bacilysin biosynthesis. Next, a deletion vector for distruption of yvfI gene in B.subtilis PY79 was constructed for further verification of the effect of yvfI gene on bacilysin biosynthesis. The introduction of (yvfI::spc) mutation into PY79 resulted in the elimination of bacilysin biosynthesis.