A multiscale computational study to elucidate dynamics, reactivity, and inhibition of enzymes

Abstract

Bu çalışma, enzim kataliz mekanizmalarının ya da inhibitasyonlarının atomik ve elektronik düzeyde daha iyi anlaşılmasına yönelik olarak hesaplamalı modelleme tekniklerinin çok ölçekli (multiscale) bir yaklaşımla kullanıldığı kapsamlı bir çalışmayı içermektedir. Çalışmada incelenen iki enzimden ilki olan Protein Arginin Deiminaz 2 (PAD2), insanlarda bulunan beş PAD izoziminden biridir ve özellikle epigenetik regülasyon, gen ekspresyonu ve bağışıklık yanıtı gibi birçok fizyolojik süreçte görev alır. PAD2, arginin kalıntılarını sitrulline dönüştürerek histon modifikasyonlarını etkiler; bu yönüyle meme kanseri gibi çeşitli hastalıkların progresyonunda önemli bir role sahiptir. Katalitik mekanizmasında yer alan Cys647, His471 ve Asp473 kalıntıları, enzimin substrata bağlanması ve nükleofilik saldırı gerçekleştirmesi açısından kritik öneme sahiptir. PAD2'nin bu biyolojik önemi, onu hem mekanistik açıdan ilgi çekici bir model sistem hem de terapötik müdahale için potansiyel bir hedef haline getirmiştir. Çalışmada incelenen ikinci enzim olan SARS-CoV-2 Ana Proteazı (Main Protease, Mpro) ise, koronavirüsün replikasyonu sırasında poliproteinlerin fonksiyonel pro- teinlere işlenmesinden sorumludur. Bu enzim, virüsün yaşam döngüsünde kritik bir rol oynadığı için antiviral ilaç geliştirme çalışmalarının başlıca hedeflerinden biri olmuştur. Mpro, homodimerik yapıya sahip olup, her bir monomer yaklaşık 306 amino asitten oluşur ve yapısında üç farklı bölge içerir. Katalitik bölgesi, His41 ve Cys145 kalıntılarından oluşan bir ikili tarafından tanımlanır. Bunun yanı sıra, enzimin yapısal esnekliği ve dimerizasyonla ilişkili bölgeleri, allosterik inhibisyon için alternatif bağlanma cepleri sunar. Bu bağlamda, Mpro hem doğrudan inhibitör tasarımı hem de ilaç yeniden konumlandırma (drug repurposing) stratejileri açısından yüksek öneme sahiptir. Her iki enzim de terapötik hedef olarak ön plana çıkmakta olup, bu tezde hem katalitik mekanizmalarının atomistik ve elektronik düzeyde detaylandırılması hem de potansiyel inhibitörlerin hesaplamalı yöntemlerle belirlenmesi amaçlanmıştır. Geliştirilen çok ölçekli hesaplama stratejisi sayesinde, hem PAD2'nin sitrullinasyon mekanizması hem de Mpro'nun inhibitör bağlanma davranışı moleküler düzeyde incelenebilmiştir. PAD2 enzimi, arginin artıklarını sitrulline dönüştürerek proteinlerin fonksiyonlarını değiştiren, bu yönüyle hem bağışıklık sisteminde hem de bazı kanser türlerinde önemli rol oynayan bir enzimdir. Bu çalışma kapsamında, PAD2'nin substratla etkileşimi ve katalitik mekanizması, toplamda 50 mikrosaniyeyi aşkın süreye yayılan moleküler dinamik (MD) simülasyonları ile detaylı bir şekilde incelenmiştir. Beş farklı protonasyon modeline göre oluşturulan sistemlerde, aktif bölgedeki Cys647, His471 ve Asp473 kalıntılarının protonlanma durumlarına göre enzimin konformasyonel değişkenliği değerlendirilmiştir. MD simülasyonları sonucunda elde edilen trajektoriler, katalitik açıdan uygun geometriye sahip konfigürasyonların istatistiksel olarak belirlenmesini sağlayan Yakın Saldırı Konformer (Near Attack Conformer - NAC) analizi ile taranmıştır. Belirli atomlar arasındaki uzaklık ve açı kriterlerine dayanan bu analizde, reaktif geometriye yakın olan yapılar çok adımlı filtreleme algoritmaları ile sınıflandırılmıştır. Her model için NAC yoğunluğu hesaplanmış ve en olası reaksiyon yolları tanımlanmıştır. Bu analizlere ek olarak, NAC konfigürasyonları üzerinde hesaplanan Lineer Etkileşim Enerjisi (LIE) değerleri, bu adımlı mekanizmanın sadece geometrik değil, aynı zamanda enerjetik olarak da tercih edilir olduğunu ortaya koymuştur. Aktif bölge ile substrat arasındaki temas yüzeyi, yüzey temas analizi ile detaylandırılmış, katalitik uygunluk gösteren sistemlerde daha yüksek temas alanı ve daha düşük RMSD değerleri gözlemlenmiştir. Reaksiyon yollarının kimyasal geçerliliğini değerlendirmek amacıyla, moleküler dinamik (MD) simülasyonlarından elde edilen ve geometrik olarak tepkime başlangıç yapısını işaret eden NAC konfigürasyonları üzerinde kuantum mekaniksel (QM) hesaplamalar gerçekleştirilmiştir. Bu hesaplamalar, özellikle PAD2 enziminin katalitik mekanizmasını atom düzeyinde açıklığa kavuşturmak üzere tasarlanmıştır. Hesaplamalarda, benzer çalışmalarda yaygın olarak tercih edilen Density Functional Theory (DFT) yöntemi kullanılmıştır. Hesaplamalar M06-2X fonksiyoneli ve 6-31+G(d,p) baz seti kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm kuantum kimyasal hesaplamalar, suyun çözücü etkilerini modellemek amacıyla Polarizable Continuum Model (PCM) yöntemi kullanılarak çözücü ortamında gerçekleştirilmiştir. Her bir önerilen mekanizma için; reaktan (R), geçiş durumu (TS), ara ürün (Int) ve ürün (P) yapılarına ait geometri optimizasyonu yapılmıştır. Bu yapıların intrinsik reaksiyon koordinatı (IRC) analizleri ile geçiş durumlarının gerçekten R ve P yapıları arasında bir enerji geçiş noktası olduğu doğrulanmıştır. Optimizasyon devamında frekans hesabı ile: Sıfır nokta enerjisi (ZPE), Termal entalpi (H), Gibbs serbest enerjisi (G) ve Imajiner frekans sayısı ve değeri (sadece TS için) değerleri elde edilmiştir. PAD2 enzimi tarafından katalizlenen sitrülinleşme reaksiyonu, substratın aktif bölgeye bağlanmasının ardından, katalitik sistein (Cys647) kalıntısının aktive olmasıyla başlar. Reaksiyonun, substrat destekli (substrate-assisted) bir mekanizmayı izlediği öne sürülmektedir. Aktif bölgede, katalitik aktiviteye asit/baz göreviyle yardımcı olabilecek iki aday kalıntı mevcuttur: His471 ve Asp473. Bu kalıntılardan hangisinin genel baz olarak hareket edeceği, aktif bölgedeki yük dağılımını ve dolayısıyla reaksiyon yolunu önemli ölçüde etkileyecektir. Çalışmamızda ilk olarak, başlangıç durumu olan State N'den itibaren Cys647'nin aktive olduğu reaksiyon yollarını inceledik. Daha sonra ise, Cys647'nin nükleofilik saldırı yapmaya hazır olduğu State I'den başlayan üç farklı sitrülinleşme reaksiyonu yolunu modelledik. Üç farklı reaksiyon mekanizması için gerçekleştirilen kuantum mekaniksel hesapla- malar, her bir yolun aktivasyon enerjisi, serbest enerji değişimi ve geçiş durumlarına ait imajiner frekansları üzerinden karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir. RM1 (adımlı mekanizma), yaklaşık 18.4 kcal/mol ile en düşük aktivasyon enerjisine sahip olup, aynı zamanda ürün oluşumu yönünde –6.5 kcal/mol değerinde serbest enerji değişimi göstermektedir. RM2 (su destekli adımlı mekanizma), RM1'e benzer bir yol izlemekte ancak su molekülünün aktif bölgede yer alması nedeniyle biraz daha yüksek bir aktivasyon enerjisine (20.9 kcal/mol) sahiptir. Bu mekanizmanın serbest enerji değişimi –4.8 kcal/mol olarak belirlenmiştir. RM3 (His471 destekli mekanizma) ise Asp473 ile birlikte His471'in de reaksiyona katıldığı bir yol olup, 23.1 kcal/mol aktivasyon enerjisi ve –2.1 kcal/mol serbest enerji değişimi ile nispeten daha az avantajlı bir profilde seyretmektedir. Hidroliz reaksiyonu, sitrülin ürününün oluşumunu ve enzimin rejenerasyonunu birlikte temsil eden önemli bir adımdır. Bu süreç, aktif bölgedeki His471 kalıntısının baz olarak davranıp su molekülünden bir proton çekmesiyle başlar. Böylece nükleofilik bir su molekülü aktive edilir ve ardından substratın guanidino grubu ile Cys647 arasındaki S–Cγ bağının kırılması ile sitrülin ürünü oluşur. Mekanizmada His471, sterik kısıtlamalar nedeniyle Asp473 yerine genel baz görevini üstlenirken, Asp473 ise substratın aktif bölgeye doğru konumlanmasında yapısal destek sağlar. Zhao ve arkadaşlarının çalışmasında da belirtildiği gibi, aktif bölgedeki kalıntıların pozisyonu ve substrat farklılıkları, guanidino grubu modifiye edilmiş enzimlerde hidroliz mekanizmasının çeşitlilik gösterebileceğine işaret etmektedir. Bu noktada, DFT hesaplamalarının belirsizlik sınırları göz önünde bulundurulduğunda, tek bir reaksiyon yolunun seçilmesinin mümkün olmadığına dikkat çekmek gerekir. Ancak, önceki moleküler dinamik simülasyonlarımızla birlikte değerlendirildiğinde, deneysel olarak önerilen RM3 yoluna alternatif olarak RM1 mekanizması da S-alkil ara ürününün oluşumunda geçerli bir yol olarak düşünülmelidir. Bu ara ürünü izleyen hidroliz reaksiyonu ise sitrülin üretimini sağlar. Bu bulgular, PAD2 izoenzimi için mekanizmaya dayalı yeni inhibitörlerin rasyonel tasarımı açısından değerli bir temel oluşturabilir. Ayrıca bu veriler göstermektedir ki, RM1 mekanizması (Asp473'ün Cys647'i aktive ettiği adımlı yol) en düşük enerji bariyerine ve en kararlı ürün geometrisine sahiptir. Asp473 tarafından gerçekleştirilen proton transferinin gerçekleştiği geçiş durum- larında, protonun hareket ettiği bölgede yük yoğunluğu kayması net olarak gözlem- lenmiş ve bu durum, adımlı mekanizmanın termodinamik olarak desteklendiğini göstermiştir. Bu tür analizler, sadece mekanizmanın geçerliliğini değil, aynı zamanda enzim içi etkileşimlerin nasıl çalıştığını da netleştirmiştir. Tezin son kısmında, SARS-CoV-2 virüsünün hayatta kalması ve çoğalması için hayati öneme sahip olan ana proteaz (Main Protease, Mpro) enzimi hedef alınmıştır. Bu çalışma Kürkçüoğlu-Levitas araştırma grubu ile birlikte gerçekleştirilmiştir. Mpro, virüsün poliproteinlerini aktif enzimlere parçalayarak viral replikasyonun gerçekleşmesini sağlar ve bu nedenle virüsün yaşam döngüsünde merkezi bir rol oynar. Mevcut COVID-19 ilaç geliştirme çabalarında Mpro, doğrudan inhibisyon yoluyla viral çoğalmanın durdurulması hedeflenen en kritik proteinlerden biri olarak değerlendirilmektedir. Bu bağlamda, çalışmada ilaç yeniden konumlandırma (drug repurposing) stratejisi benimsenmiştir. Bu strateji doğrultusunda, halihazırda FDA onayı almış ve piyasada kullanılan 2430 molekül, hem Mpro'nun klasik katalitik bölgesi (His41–Cys145 dyadı) hem de literatürde daha az çalışılmış olan potansiyel allosterik bölgeleri hedef alacak şekilde taranmıştır. Allosterik bölgeler, Gaussian Network Model (GNM) ve kalıntı korelasyon analizleri kullanılarak dinamik korelasyonlar temelinde belirlenmiş ve enzimin yapısal esnekliğini kontrol eden bölgeler olarak sınıflandırılmıştır. Yerleştirme (docking) çalışmaları, AutoDock Vina kullanılarak esnek molekül–protein bağlanması çerçevesinde yürütülmüş, bağlanma enerjileri (vina skorları) temel alınarak moleküller sıralanmıştır. Aktif bölgeye karşı yapılan taramalarda, özellikle selinexor, bromocriptine, diosmin ve ivermectin, –8.4 ila –9.1 kcal/mol aralığında vina skorları ile öne çıkmıştır. Bu bileşikler, His41 ve Cys145'e ek olarak Glu166, Gln189, Met49 gibi bağlanmayı destekleyen rezidülerle güçlü hidrojen bağları ve hidrofobik etkileşimler kurmuştur. Allosterik bölgeler için yapılan taramalarda ise, elbasvir (–10.2 kcal/mol) ve diosmin (–9.4 kcal/mol) en yüksek bağlanma skorlarına sahip bileşikler olarak belirlenmiştir. Elbasvir özellikle dimer arayüzünde yer alan Leu286, Asp289 ve Gln256 ile etkileşim gösterirken, diosmin'in geniş aromatik yapısı sayesinde allosterik cebin derinliğine iyi oturduğu ve pi–pi ile hidrojen bağları kurduğu gözlemlenmiştir. Docking sonuçlarını doğrulamak amacıyla, bu yüksek skorlu bileşik–protein kompleksleri için 50 ns uzunluğunda moleküler dinamik (MD) simülasyonları gerçekleştirilmiştir. Bu simülasyonlarda bileşiklerin RMSD değerleri bağlanma ceplerindeki pozisyonlarının stabilitesini gösterecek şekilde 2 Å altında kalmıştır. Özellikle selinexor ve elbasvir komplekslerinde, simülasyon boyunca kalıcı hidrojen bağları ve düşük RMSF (root mean square fluctuation) değerleri gözlemlenmiştir. Simülasyonlardan elde edilen yapılar üzerinde MM/GBSA yöntemine dayalı bağlanma serbest enerjisi (∆Gbind) hesaplamaları yapılmıştır. Sonuçlar, hem aktif hem de allosterik bölgelerde bağlanan adayların enerjetik olarak güçlü inhibitör potansiyeli taşıdığını göstermektedir. Özellikle selinexor (≈−32.5 kcal/mol), elbasvir (≈−35.7 kcal/mol) ve bromocriptine (≈−28.1 kcal/mol) gibi bileşikler öne çıkmıştır. Ek olarak, per-residue decomposition analizi bağlanma enerjisine en çok katkı sağlayan amino asit kalıntılarını ortaya koymuştur. Aktif bölgede His41, Glu166, Gln189 ve Met165; allosterik bölgelerde ise Leu286, Gln256, Ser284 ve Gln288 gibi kalıntılar, ligand stabilizasyonunda önemli rol oynamaktadır. Bu tez, Protein Arginin Deiminaz 2 (PAD2) enzimi ve SARS-CoV-2 ana proteazı (Mpro) üzerinde yürütülen kapsamlı hesaplamalı analizlerle, iki farklı biyolojik sistemdeki dinamikleri, tepkime mekanizması ve inhibisyonlarını hem atomik hem de elektrnoik seviyede araştırarak aydınlatılmasına katkı sağlamıştır. Çalışmada, çok ölçekli modelleme yaklaşımları entegre edilerek hem reaksiyon yollarının doğrulanması hem de potansiyel inhibitörlerin keşfi yönünde önemli katkılar sunulmuştur. Bu bağlamda, tezde uygulanan çok ölçekli hesaplama çerçevesi; klasik MD, NAC analizi, kuantum mekanik optimizasyonlar, simülasyon sonrası enerji hesaplamaları ve bağlanma bölgesi ayrıştırmaları gibi yöntemleri bütünleştiren modüler bir yapıya sahiptir. Bu yaklaşım, sadece PAD2 ve Mpro'ya özgü değil, gelecekte diğer enzim sistemlerine de doğrudan uyarlanabilir olması bakımından yüksek ölçeklenebilirlik ve tekrar kullanılabilirlik özellikleri taşımaktadır. Sonuç olarak, bu çalışma yalnızca PAD2'nin sitrullinasyon mekanizmasındaki çelişkili literatür verilerini açıklığa kavuşturmakla kalmamış, aynı zamanda SARS-CoV-2 Mpro enzimi için klasik inhibitör yaklaşımlarının ötesine geçen, dinamik merkezli allosterik bölgeyi hedeflemeyi mümkün kılan yenilikçi bir hesaplama yaklaşımı ortaya koymuştur. Bu yönüyle çalışma, hem temel bilimler düzeyinde hem de uygulamalı ilaç keşfi süreçlerinde önemli bir köprü işlevi görmektedir.