Fen Bilimleri Enstitüsü

Bu topluluk için Kalıcı Uri

http://hdl.handle.net/11527/8
İTÜ Bünyesinde lisansüstü yönetmeliklere uygun olarak çağdaş bilim ve teknolojinin gelişmesini izleyip bunları ülkemizde uygulama alanına aktarabilecek araştırma niteliği kazanmış yüksek lisans ve doktora öğrencisi yetiştirmek üzere gerekli faaliyetlerini sürdürmektedir.

Gözat

Yazar "Abacı, İrem" ile Fen Bilimleri Enstitüsü'a göz atma
  • Öge
    Hücre Kültürü Modellerinde Mefv Geni Alternatif Kırpılmış Transkriptlerinin Ekspresyon Modellerinin Analizi
    (Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014-02-21) Abacı, İrem ; Turanlı, Eda Tahir ; 10021737 ; Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji ; Molecular Biology and Genetics
    Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA), bölgemizdeki görülme sıklığı 1/200 ila 1/1073 arasında olan otoenflamatuvar bir hastalıktır. Temel semptomları, periyodik olarak tekrarlanan ağrılı karın zarı, akciğer zarı, eklem sıvısı ve kalp dış zarı enflamasyonlarıdır. Bu ataklar sonucu “amiloid” denilen protein çökeltilerinin oluşma olasılığı yüksektir, tedavi edilmezse amiloid birikimi böbrek yetmezliğine bağlı olarak ölüme sebebiyet verebilir. FMF hastalığıyla ilintili olan gen MEFV olup FMF hastalarında bu genin 200’den fazla varyasyonu tanımlanmıştır. FMF hastalığının kalıtım modeli otozomal resesif olarak kabul edilmesine rağmen bazı durumlar baskın geçişli ya da bileşik heterozigot geçişli olarak raporlanmış olup, bazılarında hiç mutasyon gözlenmemiştir. MEFV geni enflamatuvar/regülatör gen olup “Pyrin/Marenostrin (P/M)” adı verilen bir proteini kodlar. P/M, pro-enflamatuvar elementlerle etkileşim halinde enflamazom kompleksinin bir parçasını oluşturarak enflamasyon yolizine dahil olur. Bununla birlikte MEFV geninin Behcet Sendromu, Crohn’s hastalığı ve gut gibi diğer otoenflamatuvar hastalıklarla da ilgili olduğu kanıtlanmıştır. Alternatif kırpılma, transkripsiyon aşamasında gen ekzonlarının farklı sıralarda birleştirilmesi sonucu aynı genden türetilmiş çeşitli protein izoformlarının oluşmasını sağlayan bir süreçtir. “Anlamsızlık aracılıklı yıkım (AAY)” adı verilen bir mekanizma ile birlikte alternatif kırpılma, gen ekspresyonu ve protein üretiminin düzenlenmesi ve çeşitli protein yapılarının evrilmesi süreçlerinin bir parçasıdır. Aynı genden üretilen çeşitli protein izoformlarından, hücre gelişim seviyesine göre işlevsel olmayan protein AAY aracılığıyla parçalanır. Hücrede bu mekanizmalar, ihtiyaç duyulan proteinin üretilmesinde düzenleyici olarak işlev görür. Kompleks hastalık patofizyolojilerinde önemli bir rol oynadığı düşünülen bu süreçler, aynı zamanda gelişimsel farklılaşma yolizlerinde de oldukça etkin bir rol üstlenir. Alternatif kırpılmanın kanser, Parkinson, Alzheimer ve Kistik fibrozis gibi hastalık patolojilerinde görülen moleküler etkileşimlerde önemli rolü bulunduğu bilinmektedir. MEFV geni transkriptleri çeşitli alternatif kırpılmış formlarda üretilmektedir. Özellikle lökositlerde ve eklem sıvısında en yaygın olarak gözlenen MEFV alternatif kırpılmış formları şunlardır: MEFV-8ext (8. ekzonun ek bir kısmını içeren izoform), MEFV-4a ( 5, 6, 7, 8, 9 ve 10. ekzonları içermeyen, 4. ekzonun bir kısmını içeren form), MEFV-2a (2. ekzonun bir parçasını içeren form) ve MEFV-2Δ (2. ekzonu içermeyen transkript). MEFV geninin 2. ekzonunun proteinin lokalizasyon tayininde önemli rol oynadığı düşünülmektedir. 2. ekzonun delesyonunun, ortamda nükleer lokalizasyon sinyalleri bulunmasına rağmen molekülün hatalı lokalizasyonuna yol açtığı bilinmektedir. Grubumuzca yapılan bir çalışmada da MEFV-2Δ izoformunun FMF hastalarında sağlıklı kontrollere göre daha yüksek oranda bulunduğu gösterilmiştir (p=0,026). Bu buluntular, enflamasyon yolizi ile MEFV-2Δ izoformunun ekspresyon seviyesi arasında bir bağlantı olasılığını işaret etmektedir. Gen ekspresyon seviyesi belirleme ve karşılaştırma çalışmalarında sıklıkla kullanılan yöntemlerden biri ters transkripsiyon - relatif kantitasyondur. Bu tip çalışmalarda, öncelikle örneklerden RNA izolasyonu yapılır ve RNA’dan, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile komplementer DNA sentezlenir. Komplementer DNA sentezi için rastlantısal primerler, “oligo-dT” primerleri veya hedefe özgü dizayn edilmiş primerler kullanılabilir. Bu üç yöntemden rastlantısal primerler ve oligo-dT primerleri, izole edilmiş RNA havuzu içinden herhangi bir RNA’ya bağlanarak hedef gözetmeksizin reaksiyon sonunda karışık bir komplementer DNA içeriği oluşmasını sağlarlar. Hedefe özgü primerler ise belirli bir RNA molekülüne bağlanarak özellikle bu RNA’ya ait bir komplementer DNA sentezini sağlarlar. Rastlantısal ve oligo-dT primerleri, tek reaksiyon ile birden fazla çeşitte komplementer DNA sentezine olanak verirken hedefe özgü primerler, bir reaksyonda tek tip komplementer DNA sentezini sağlar. Hedefe özgü primerler ile nadir olarak üretilen bir transkriptin tespiti sağlanabilir. Literatürde yer alan çalışmalarda, gen havuzu içinde nadir olarak üretilen transkriptlerin tespitinde hedefe özgü primerlerin daha doğru sonuç verdiği belirtilmiştir. Çalışmamızın temel hipotezi enflamatuvar yolizlerinde MEFV’in kesin rolünün belirlenmesidir. Enflamasyonda MEFV geninin rolünü anlamak için öncelikle insan primer lökosit kültüründe bir enflamasyon modeli tasarladık. Lökositleri aktive etmek için lipopolisakkarit (LPS) kullandık ve sonuç enflamatuvar sitokin seviyesini ölçtük. İlk buluntularımız primer kültür enflamasyon modelinde düşük sitokin seviyesini göstermekteydi. Bunun üzerine HL-60 premiyelotik hücre hattı hücrelerini kullanarak başka bir enflamasyon modeli hazırladık. Sonuç olarak Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) uygulanmış HL-60 hücrelerinin LPS ile uyarımı, proenflamatuvar bir sitokin olan İnterlökin 1-beta (IL-1β)’nın yüksek oranda üretimine yol açtı. Daha sonra, MEFV-2Δ üretimini atak dönemindeki AAA hastalarının eklem sıvısı ve kan örneklerindeki diğer transkriptlerle karşılaştırdık. Bunun için örneklerden RNA izolasyonunu gerçekleştirdikten sonra Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) yöntemini Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Q-RT PCR) yöntemi ile birlikte kullandık. MEFV-2Δ transkriptinin diğer RNA’lar içinde nadir üretilen bir ürün olması sebebiyle, ekspresyon profilinin doğru karşılaştırılabilmesi için iki farklı cDNA sentez stratejisi uyguladık. Bu stratejiler MEFV alternatif kırpılmış transkriptlerinden rastlantısal primerler ile komplementer DNA(cDNA) sentezi ve hedefe özgü primerler ile cDNA sentezi idi. Enflamasyon durumunu deneyin her bir basamağındaki enflamatuvar sitokinler pro-IL-1β ve Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α) üretimi seviyesiyle ve sağlıklı kontrollerle karşılaştırdık. Enflamasyon modelini PMA ve LPS uygulanmış hücrelerde başarı ile gerçekleştirdik. Ayrıca hedefe özgü primerler ile sentezlenen cDNA’lar ile rastlantısal primerlerle sentezlenmiş cDNA’lara göre daha doğru sonuçlar alınmıştır. Buna göre hedefe özgü primerlerle sentezlenmiş cDNAnın taslak DNA olarak kullanıldığı durumda, gerçek zamanlı PCR’da referansa göre belirlenen eşik değer floresan sinyalinin aşıldığı döngü sayısı (Ct) ortalama 25 iken rastlantısal primerle sentezlenmiş cDNA’nın taslak olarak kullanıldığı reaksiyonlarda bu değerler ortalama 40 olarak bulunmuştur. Sonuç olarak, enflamasyon durumunda diğer transkriptlerin ekspresyon seviyesinin düşmesine rağmen MEFV-2Δ transkriptinin ekspresyonunun arttığı gözlenmiştir (enflamasyon modelinde p=0,024, sinoviyal sıvı örneklerinde p=0,037). Bu artış, özellikle hedefe özgü primerlerle yapılan sentezlenmiş komplementer DNA karşılaştırmalarında belirgin olarak gösterilmiştir. Enflamasyon ile paralel olarak gözlenen MEFV-2Δ ekspresyon artışı akut FMF durumundaki hastaların sinoviyal sıvı ve kan örneklerinden alınan sonuçlarla doğrulanmış olup, MEFV-2Δ transkriptinin enflamatuvar yolizinde önemli bir rolü olabileceği hipotezi desteklenmiştir. Daha yüksek sayıda hasta örneklemesi ile MEFV-2Δ izoformu ve pyrin ile etkileşen proteinlerin tanımlaması çalışmanın daha sonraki basamakları için gereklidir.