Pah Birikim Ve Arınım Kinetiklerine Deneysel Ve Sayısal Yaklaşım; Deniz Algi Ve Midyesi İle Besin Zinciri Çalışması

Abstract

Besin zincirinde PAH biyobirikimi ve transferinin modellenmesi çalışmasında, Akdeniz midye türü olan Mytilus galloprovincialis ve deniz mikroalglerinden Phaeodactylum tricornutum kullanılarak laboratuvar koşullarında, bir besin zinciri oluşturulmuştur. Laboratuvar deneyleri birikim ve arınım süreçleri olmak üzere iki aşamada gerçekleştirilmiştir. Birikim aşamasında, seçilen alg türü P. tricornutum, iki farklı halka sayısına sahip poliaromatik hidrokarbonlara (PAH) maruz bırakılmıştır. Laboratuvar deneylerinde kullanılmak üzere, iki halkalı PAH olarak fenantren (PHE) ve üç halkalı PAH olarak benzo(a)antrasen (BaA) seçilmiştir. Toksisite çalışmalarında biyo kullanılabilirlik açısından önemli olması nedeniyle deneylerde kullanılacak PAH konsantrasyonları, sudaki çözünürlük limitlerinin altında kalacak şekilde belirlenmiştir. BaA?in sudaki çözünürlük limiti 11 µg L-1 civarında ve PHE?nin sudaki çözünürlüğünün 1200 µg L-1 civarında olması nedeniyle, deneylerde kullanılmak üzere BaA için 3, 6 ve 9 µg L-1 ve PHE için 250, 500 ve 1000 µg L-1 konsantrasyonları çalışma konsantrasyonları olarak belirlenmiştir. Mikroalg ve midyeler, belirlenen konsantrasyonlara BaA için 15 ve PHE için 11 gün boyunca maruz bırakılmış, hemen ardından sırasıyla 14 ve 11 gün boyunca herhangi bir PAH?a maruz bırakılmadan temiz deniz suyu içinde arınmaya bırakılmışlardır. Birikim ve arınma aşamalarından oluşan deney sistemi kısaca şöyle açıklanabilir: Deney düzeneğinde, maruz bırakılacak her bir PAH konsantrasyonu için farklı bir akvaryum oluşturulmuştur. Belirlenen PAH konsantrasyonlarına ek olarak deney sistemine, BaA ve PHE için ayrı birer kontrol akvaryumu eklenmiştir. Belirlenen konsantrasyonlardaki PAH?lar, besin kaynağı olarak kullanılan alg hücrelerine yeterince nüfus etmesi amacıyla 24 saat öncesinden alglerle birlikte karanlık bir ortamda tutulmuş, takip eden gün PAH?a maruz bırakılmş algler akvaryumlardaki midyelere besin kaynağı olarak verilmiştir. Maruz bırakılma süresince bu işlem, her bir akvaryum için günlük olarak tekrar edilmiştir. Arınım sürecinin deney düzeneği açısından tek farkı, besin kaynağı alglerin PAH?lara 24 saat öncesinden maruz bırakılmaması ve akvaryumlara her gün temiz deniz sularının eklenmesi olmuştur. Yürütülen çalışmada, iki farklı ölçekte birikim ve arınım deneyleri gerekleştirilmiştir: büyük ve küçük ölçekli birikim ve arınım deneyleri. Bu deneylerdeki işlemler aynı sırayı takip etmekle birlike tek farkları midye sayısının ve deniz suyu hacminin 1/5 oranında azaltılmış olmasıdır. Azaltılan değişkenler dışında, maruz bırakılan PAH ve alg konsantrasyonlarında herhangi bir değişiklik yapılmamıştır. Büyük ölçekli birikim ve arınım deneyleri esnasında, her üç ya da dört günde bir akvaryumlardan midye örnekleri alınarak midye dokularında biriken PAH konsantrasyonları, GC-MS (gaz komatografisi-kütle spektrofotometresi) ile analiz edilmiştir. Bu analizler sonucunda, midyelerin birikim ve arınım dönemleri için kinetik hız sabitleri belirlenmiştir. Hız sabitlerinin belirlenmesinde, birinci derece diferansiyel denklemler kullanılmıştır. Daha sonra, belirlenen birikim ve arınım kinetik hız sabitleri, geliştirilen PAH biyobirikimi ve transferi model çalışmasında girdi verisi olarak kullanılmıştır. Büyük ölçekli deney sisteminden alınan midye örneklerine aynı zamanda iki farklı biyogösterge deneyi de uygulanmıştır. Bu deneyler filtrasyon hızı ve lizozomal membran stabilitesidir. Midyelerin maruz bırakıldıkları PAH konsanstrasyonuna verdikleri fizyolojik tepkiler, filtrasyon hızı biyogösterge deneyi ve hücresel tepkiler lizozomal membran stabilite biyogösterge deneyi ile gözlemlenmiştir. Küçük ölçekli deney sisteminde ise midyelerin filtrasyon hızları, içinde bulundukları akvaryumlardan her 24 saatte belirli aralıklarla alınan su örnekleri kulanılarak takip edilmiş ve hesaplanan filtrasyon hızı değerleri, geliştirilen model çalışmasında girdi verisi olarak kullanılmıştır. Deniz ortamında yaşayan midyelerin, besin (algler) ve çevrelendikleri ortam (deniz suyu) aracılığıyla PAH?lara maruz bırakılması sonucunda dokularında biriken PAH konsantrasyonlarının belirlenmesi amacıyla matematiksel bir model oluşturulmuştur. Bu model, temel olarak laboratuvarda gerçekleştirilen birikim ve arınım deneylerine dayandırılmıştır. Kinetik hız sabitleri ve filtrasyon hızı gibi daha önce bahsedilmiş olan model girdi verilerine ek olarak akvaryumlardaki midye sayısı, midye ağırlığı, besin olarak kullanılan alg hücreleri sayısı, akvaryumlardaki deniz suyu hacmi ve her bir akvaryuma eklenen ve her biri deniz suyu çözünürlük limitlerinin altında kalmak üzere belirlenmiş PAH konsantrasyonları da modelin diğer girdi verilerini oluşturmaktadır. Geliştirilen model, temel olarak her biri farklı bir bölmeyi temsil eden üç farklı diferansiyel denklemden oluşmaktadır. Bu bölmeler, maruz bırakılan organizma (midye), çevreleyen ortam (deniz suyu) ve organizmanın besin kaynağını (alg) temsil etmektedir. Her bir diferansiyel denklem, deney sistemi göz önünde tutularak ve her bir bölmenin birbirlerine kinetik hız sabitleri ve filtrasyon hızı ile bağlantılı olması düşünülerek formüle edilmiştir. Böylece, birbirleri ile etkileşimli; ancak dış etkenlere kapalı bir model oluşturulmuştur. Modelin, dış etkenlere kapalı çevrim sistemi düşünülerek oluşturulmasıyla, midyedeki PAH birikimi, arınımı ve transferi tahminleri için temel bir model çalışması gerçekleştirilmiştir. Böylece midyede birikebilecek en yüksek konsantrasyon oranları gözlemlenebilecektir. Buharlaşma ve bozunma gibi dış etkenler neticesinde oluşabilecek PAH konsantrasyonlarındaki olası azalmaların, denklemlere eklenecek çeşitli parametreler ile temsil edilmesi ve bunların daha sonraki model çalışmalarına ilave edilmesi düşünülmektedir. Temel olarak, girdi verileri, diferansiyel denklem sistemi ve çıkış grafiklerinden oluşan model; bilim, mühendislik ve matematik konularında kullanılmakta olan hesaplama yazılımlarından Mathematica yazılım programında yazılmıştır. Diferansiyel denklem sistemi, seçilen yazılım programında var olan 4. derece Runge-Kutta sayısal entegrasyon yöntemi ile çözülmüş ve yine aynı programın eğri uydurumu özelliği ile grafik olarak elde edilebilmiştir. Bu özellikler aynı zamanda yazılım programı seçimi konusunda da etkili olmuştur. Yazılan program kodu öncelikle başarılı bir şekilde çalıştırılmıştır ve maruz bırakılan konsantrasyonun günlere bağlı değişimleri görsel olarak elde edilmiştir. Ardından, teorik değerlere dayanarak elde edilmiş olan PAH konsantrasyonu-gün grafikleri, deneysel verilerle karşılaştırılmıştır. Bu karşılaştırma işlemi, üç farklı konsantrasyon ve iki farklı PAH türü olmak üzere toplamda altı kez olmak üzere her bir akvaryum için ayrı ayrı yapılmıştır. Daha sonra, her bir PAH için elde edilen sonuçlar bir araya getirilerek tek bir grafik altında toplanmıştır. Tüm teorik hesaplamalar deneysel verilerle aynı grafik üzerinde karşılaştırılmış ve modelin, temelde PAH birikimi, arınımı ve transferini temsil edebilecek nitelikte olduğu görülmüştür. Bu nedenle, aynı model kodu kullanarak farklı senaryolar üzerinde çalışılmıştır. Bu senaryolar sırayla şöyle özetlenebilir: Öncelikle besin kaynağı olarak kullanılan alglerin sayısındaki değişimin etkisi araştırılmıştır. Saha çalışmaları sırasında yapılan deniz suyundaki parçaçık sayımlarından görece yüksek olan sonuçlardan biri model girdisi olarak denenmiştir. Ölçülen deniz suyu parçacık miktarı, deneydeki alg sayısının yaklaşık üç katı olmasına rağmen sonuçlarda belirgin bir farklılık olmamıştır. Bir diğer senaryo ise farklı türde deniz alglerinin midyelerin besin kaynağı olarak kullanılması üzerine gerçekleştirilmiştir. Literatür çalışmalarından altı farklı türde deniz algine ait biyokonsantrasyon değerleri hesaplanmış ve model girdisi olarak bu değerler kullanılmıştır. Deneylerde kullanılan alg sayısında hiçbir değişim yapmadan model kodu farklı alg türleri için çalıştırılmıştır. Tüm sonuçlar karşılaştırıldığında farklı biyokonsantrasyon faktörlerinin, sonuçları farklı şekillerde etkilediği gözlenmiştir. Bu gözlemler ile üç halkalı PAH?lardan olan BaA ve iki halkalı PAH?lardan olan PHE?in farklı birikim eğilimleri gösterdiği anlaşılmıştır. Alglerle yapılan model senaryoları sonucunda, alglerin biyokonsantrasyon değerlerinin artmasıyla BaA?in dokularda birikme oranının azaldığı, diğer yandan alglerin biyokonsantrasyon değeri arttıkça PHE?in dokularda birikme oranının arttığı sonucuna varılmıştır. Seçilen PAH?ların kimyasal özellikleri incelendiğinde, bu farklılığın sudaki biyolojik kullanılabilirlik farklılıklarından ve sudan uzaklaşma özelliklerinden meydana geldiği anlaşılmaktadır. Algler dışında değiştirilebilecek başka bir parametre olan midye sayıları ile de çeşitli senaryolar gerçekleştirilmiştir. Aynı deney koşulları altında, sadece midye sayıları tüm deney boyunca hiç değişmeden (ara örneklemeler yapılmadan) olduğunun iki katına çıkarıldığında elde edilen PAH konsantrasyonlarında yaklaşık %30-35 oranında azalma göstermiştir. Tüm bu senaryo değişkenlerine ek olarak, birikim ve arınım dönemlerinin süreleri de modelde değiştirilebilecek parametrelerdendir. Gün sayıları, deneylerdeki gün sayılarının iki ve dörder katına çıkarılmış ve model sonuçları elde edilmiştir. Sadece gün sayısı arttırılarak yapılan denemelerde, midyelerdeki BaA konsantrasyonu seviyesinin PHE konsantrasyonu seviyesine kıyasla 1/3 oranında daha yavaş bir hızla kararlı duruma ulaştığı gözlenmiştir. Laboratuvar ortamında gerçekleştirilen deney sistemine dayanan matematiksel model, midyedeki PAH birikim, transfer ve arınımını göstermek açısından eksiksiz değildir. Tamamlanması gereken noktalardan en göze çarpanı uzun süreli maruz bırakma deneyleri için eklenmesi gereken midyelerin büyüme oranı parametresidir. Bunun dışında, PAH?ların buharlaşması ve bozunması gibi parametreler de modele eklenebilir. Bu gibi eksikler tamamlanmak üzere daha sonraki çalşmalara bırakılmıştır. Sonuç olarak, oluşturulan model çalışması, her seferinde yeniden deney yapma ihtiyacını azaltmış, elde edilen sonuçlar potansiyel senaryolar için midyelerde biriken PAH konsantrasyonu seviyelerinin ve ardından arınma süreci sonucu ulaşılabilecek konsantrasyon seviyelerinin tahmini için bir öngörü aracı olarak kullanılabileceğini göstermiştir.

In this study, a basic food chain of aquatic environment was formed with Mediterraneaen mussel species Mytilus galloprovincialis fed with marine diatom Phaeodactylum tricornutum. P. tricornutum was exposed to polyaromatic hydrocarbons (PAHs) during the uptake stage of the experiments. Two different kinds of PAHs were selected in order to represent two and three ring PAHs; phenanthrene (PHE) for two ring and benzo(a)anthracene for three ring PAH. Mussels were exposed to three different concentrations of selected PAHs under solubility limits through the routes of food (algae) and surrounding environment (seawater). Exposed concentrations were 3, 6 and 9 µg L-1 for BaA and 250, 500 and 1000 µg L-1 for PHE. Durations of the uptake stages were 15 days for BaA exposure and 11 days for PHE exposure. This period was followed by depuration stage as 14 days for BaA and 11 days for PHE exposures. Two different scales of experiments were performed with the same exposure concentrations: large and small scale uptake and depuration experiments. Exposure concentrations remained same whereas the number of exposed mussels and the volume of seawater were reduced in the small scale experiments. Mussels were sampled at each three or four days of the uptake and depuration periods of the large scale experiment. PAH concentrations in sampled mussel tissues were determined with GC-MS (gas chromatography-mass spectrophotometry). Kinetic rate constants of mussels were calculated with the first order differential equations during the uptake and depuration periods. These kinetic rate constants were used as input parameters of the developed model. In addition, two biomarker methods were applied to the sampled mussels during the large scale experiment. These biomarkers were filtration rate and lysosomal membrane stability. Physiological and cellular effects of exposed PAH concentrations were observed with filtration rate and lysosomal membrane stability biomarkers, respectively. In the small scale uptake and depuration experiment, filtration rates of mussels were observed during 24 hours and used as input parameters of the developed model. Additional to the kinetic rate constants and filtration rate measurements, parameters such as mussel number, mussel weight, algae number, seawater volume and exposed PAH concentration were also used as input parameters of the developed model. A mathematical model was developed by using the previously stated input parameters. Three differential equations were used to represent each compartment (seawater, algae and mussel compartments) of the model. The model was developed to determine the concentration levels of exposed PAHs in the mussel tissues. The model code was written in Mathematica software, and the output graphs were represented in the same software workbook. After the execution of the model code, PAH concentration - exposure day graphs were generated as outputs of the model. After the correctly execution of the model code, developed model was verified wih the experimental data. Although the model was developed as a closed system omitting evaporation and degradation of PAHs, experimental and model data had a good match with each other. Thus, new scenarios were generated using the same model code. These new sceanarios were generated by changing the input parameters of the model code. Input parameters of the new scenarios were different algae number, different types of marine algae, increased mussel number and increased duration of uptake and depuration periods. Input parameters were selected from field measurements and literature data for different algae number and different types of marine algae. All scenarios were successfully generated and the results indicated that the developed model can be evaluated as a prediction tool of PAH concentration levels in Mytilus glloprovincialis in the aquatic environment.