Abrb Ve Spo0a Transkripsiyon Faktörlerinin B. Subtılıs Yvfı Promotorundaki Bağlanma Bölgelerinin Bulunması

Abstract

Gram-pozitif organizmalar için model organizma olarak kabul edilen B.subtilis, ağırlıklı olarak peptid olan 20’den fazla antibiyotik üretebilmektedir. Basilisin, N ucunda L-alanine ve C ucunda doğal olmayan bir aminoasit olan L-anticapsine bulunduran iki aminoasitten oluşan bir dipeptidtir. B. Subtilis’un bazı şuşları tarafından üretilen basilisin, bazı bakteri ve mayalara karşı kullanılmaktadır ve mikrobiyal hücre duvarı sentezini engellemektedir. Basilisinin doğal olmayan L-antikapsin amino asidinin, sırasıyla ywfBG genlerinin ürünleri olan prefenat dehidrataz ve aminotransferaz enzimleri aracılığıyla üretildiği düşünülmektedir. Basilisinin biyosentezi, daha sonra bacABCDE olarak adlandırılan ywfBCDEF gen kümesi tarafından gerçekleşmektedir. Söz konusu gen kümesinin, plazmid entegrasyonu ile bozulması sonucu basilisin üretimi durmuş, ayrıca hücre özütünde basilisin sentetaz aktivitesi kaybolmuştur. Daha sonra yapılan çalışmalarda, bacABC genlerinin antikapsin üretiminden sorumlu olduğu, bacD ve bacE genlerinin ise sırasıyla amino asid ligasyonu ve basilisine karşı korunma fonksiyonlarını gerçekleştirdiği kanıtlanmıştır. phrC, comA and oppA genlerinin Tn10 mutagenez yolu ile bozulması veya comQ::cat mutasyonunun oluşturulması, basilisin biyosentezinin durmasıyla sonuçlanmıştır. Bu çalışmalar basilisin biyosentezinin global quorum sensing kontrol sistemi tarafından regule edildiğini göstermektedir. Ayrıca, basilisin üretiminin AbrB ve GTP ile negatif olarak düzenlediği gösterilmiştir. B. subtilis, vegetatif formdan durgun faza geçerken, çevresel sinyallere tepki olarak iki bileşenli sinyal iletim sitemlerinin birçoğunu ve çeşitli global düzenleyicilerini aktif hale getirir. Bu düzenleyiciler, geçiş (dönüşüm)- düzenleyicileri olarak isimlendirilir. AbrB, Spo0A, ScoC ve Cody proteinleri bu düzenleyici protein sınıfının en önemli üyelerinden birkaçıdır. AbrB ve Spo0A geçiş-düzenleyici proteinlerinin Basillus türlerinde antibiyotik ve toksin biyosentezinde önemli görevleri olduğu kesin olarak bilinmektedir. Sözkonusu basilisine geldiğimizde, basilisinin de abrB ve spo0A genleri tarafından regule edildiği gösterilmiştir. abrB geninde oluşturulan mutasyonlar sonucu basilisin üretiminde meydana gelen artış, basilisin sentezinin abrB geninin negative kontrolü altında olduğunu göstermiştir. Aynı çalışmada, spo0A geni bloke edildiğinde basilisin üreteminde büyük bir düşüş olduğu gösterilmiştir. Bacillus subtilis PY79 şuşunda basilisin üretimiyle ilgili genleri açığa çıkarmak için son zamanlarda yapılan Tn10 mutagenesis çalışmaları, transkripsiyonel düzenleyiciye benzeyen yvfI geninin (GntR ailesi) basilisin biyosenteziyle ilgisi olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, yvfI geninin basilisin üretiminden sorumlu olması nedeniyle, yvfI geninin düzenlenmesinde görev alan herhangi bir gen dolaylı olarak basilin üretiminden de sorumludur. Yukardaki çıkarımdan hareketle, DBTBS veritabanı (Sierro et al, 2008) kullanılarak B. subtilis yvfI geninin promoter dizisi, aday düzenleyici proteinlerin bağlanabileceği cis-elementlerinin bulunması için incelendi, ve AbrB ile Spo0A düzenleyici proteinleri için olası bağlanma bölgeleri bulundu. Elektromobility shift deneyi ile AbrB ve Spo0A proteinlerinin yvfI promoter DNA dizisine bağlandıkları bulunduktan sonra, söz konusu düzenleyici proteinlerin (trans-acting protenlerin) yvfI promoter dizisinde bağlandıkları bölgeleri açığa çıkarmak için DNase I footprinting deneyi gerçekleştirildi. Kapiler tabanlı araçtan elde edilen ve sonrasında GeneMapper programı kullanılarak düzenlenen electrophoregramlar incelendi ve her bir düzenleyici protein için yvfI promoter dizisi üzerinde bir bağlanma bölgesi bulundu. Elde edilen sonuçlar, AbrB ve Spo0A düzenleyici proteinlerinin, basilisin üretimini yvfI geninin ekspresyonunu transkripsiyon düzeyinde değiştirerek düzenlediklerini açığa çıkarmıştır.

The model organism for the gram-positive bacterium, B.subtilis, can produce more than 20 antibiotics which are predominantly peptides. Bacilysin is a dipeptide containing L-alanine at its N-terminal and the unusual amino acid L-anticapsine at its C terminal. It is produced by certain strains of B.subtilis against some bacteria and fungi and interferes with the synthesis of microbial cell walls. The unusual amino acid L-anticapsin moiety of bacilysin is generated through the action of a prephenate dehydratase and an aminotransferase, products of ywfBG genes, respectively. The biosynthesis of the dipeptide bacilysin depends on the ywfBCDEF gene cluster which was renamed as bacABCDE. Furthermore, disruption of these genes by plasmid integration was shown to cause loss of the ability to produce bacilysin, and also a lack of bacilysin synthetase activity in the crude extract. While bacABC genes carry the anticapsin synthesis function, the bacD and bacE genes encode for the function of amino acid ligation and self-protection to bacilysin, respectively. Distruption of phrC, comA and oppA by Tn10 transposon mutagenesis and introduction of comQ::cat mutation resulted in the elimination of bacilysin biosynthesis, demonstrating that bacilysin biosynthesis is under the feedback regulation by the components of global quorum sensing control system. Also, it was shown that bacilysin production is regulated on different levels negatively by GTP via the transcriptional regulator CodY and AbrB. During the transition-state from vegetative to stationary phase, a wide variety of two component signal transduction systems and global regulators of B. subtilis are activated in response to the environmental signals. These regulators have been termed transition-state regulators and AbrB, Spo0A, ScoC and Cody are some important members of this regulatory protein class. It is undoubtedly known that transition state regulator proteins, AbrB and Spo0A have crucial roles in the biosynthesis of antibiotics and toxins in Bacillus species. When it comes to the bacilysin, it has been proved that bacilysin is also under the regulation of abrB and spo0A genes. Insertional mutation in abrB gene resulted in an increase in bacilysin production, indicating that bacilysin synthesis is under the negative control of abrB gene and moreover it was demonstrated that spo0A blockage resulted in a crucial decrease in bacilysin synthesis. Very recently, through Tn10 mutagenesis studies that were performed to reveal related genes with bacilysin biosynthesis in Bacillus subtilis PY79 strain, yvfI gene which is similar to transcriptional regulator (GntR family) was found responsible in bacilysin production. On the other hand, since yvfI gene is essential for the bacilysin biosynthesis, any gene involved in the regulation of yvfI were considered as candidates in the regulation of bacilysin production indirectly. Subject to the foregoing provisions, in this study, yvfI gene promoter by DBTBS database was examined in order to find putative cis-elements in the promoter region of the B. subtilis yvfI gene for candidate regulatory proteins and found putative binding sites for AbrB and Spo0A regulatory proteins. AbrB and Spo0A proteins were tested for their abilities to bind the yvfI promoter DNA in electromobility shift experiment. Furthermore, DNase I footprinting of the yvfI promoter was applied in order to discover the exact regions occupied by AbrB and Spo0A trans-acting regulatory factors. According to the electropherograms obtained from the capillary-based instrument and then aligned using GeneMapper software, binding sites for each regulatory protein on yvfI promoter were determined. Data obtained in this study suggested that AbrB and Spo0A regulatory proteins have roles in the bacilysin biosynthesis by regulating yvfI gene expression on transcriptional level.