Mikaya Özgün Olarak Bağlanan Polipeptitlerin Faj Gösterim Tekniğiyle Taranması

Abstract

Bu çalışmada, tek kristal yapılı (001) muskovit mikaya özgün olarak bağlanan polipeptidlerin faj gösterim tekniği ile belirlenmesi hedeflenmiştir Seçilen bir inorganik malzemeye özgün olarak bağlanan polipeptitlerin taranması için kullanılan yöntemlerden biri de kombinatoriyel moleküler kütüphane metoduna bağlı olarak geliştirilmiş olan faj gösterim tekniğidir. Biyoteknoloji ve nano-biyoteknolojide uygulama alanı, iyonik kristal yapı oluşturabilme gibi önemli fiziksel özellikleri, elektriğe ve sıcaklığa karşı yüksek direnç gösterme, düşük ısı iletkenliği ve kimyasal tepkimelerde kararlılık gibi özellikleri olan mika bu çalışmada seçilmiştir. Ph.D.-C7C faj kütüphanesi kullanılarak iki set deney yapılmıştır.İlk set deney süresince, 3 döngü, ikinci set deney sırasında 4 döngü deney yapılmıştır. Faj gösterim tekniğinin ana basamağı olan döngülerde mümkün olabilecek kısıtlamalar vardır.Bu çalışmada söz konusu kısıtlamaları aşabilmek için fiziksel bir yöntem olan ultrasonikasyon teknolojisi ve bağlanan fajın geri kazanımı gibi yeni yaklaşımlar mikaya özgün fajlarin yüzeyden uzaklaştırılmasında uygulanmıştır. Bu yeni yaklaşımlar, döngüdeki kimyasal elusyon sonrasında sırasıyla mika yüzeyine uygulanmıştır. Sadece kimyasal elusyon, kimyasal elusyondan sonra ultrasonikasyon ve bağlanan fajin geri kazanılması metodları ile elde edilen fajların amino asitlerine ve sekanslarına bağlı ve karşılaştırmalı olarak analizleri yapılmıştır. Bağlanma mekanizmasının ilk olarak karakterizasyonu immuno-floresan mikroskobu teknikleri ile yapılmıştır. Seçilen polipeptitler özgünlük ve ilgiye göre güçlü, orta ve zayıf bağlananlar olarak sınıflandırılmışlardır. Mika yüzeyine olan özgünlüğü analiz etmek üzere, floresan mikroskobu teknikleri, titanyum tozu kullanılarak sadece güçlü bağlananlar için yapılmıştır. Bu sonuçlar şunu gösterir ki ultrasonikasyon ve bağlanan fajin geri kazanımı metotları faj gösterim metodunu daha etkin bir forma dönüştürebilir.

This study emphasizes the identification of polypeptides, which are specific to single crystal muscovite mica (001), using phage display technique. Phage display is a combinatorial-based molecular library method adapted for the selection of polypeptides with a specific binding affinity to a given inorganic material. In this study, mica which is applicable both to biotechnological and nano-biotechnological areas, was chosen based on its interesting physical properties, such as being ionic crystal, having high dielectric strength, low thermal conductivity, high temperature resistance, and being chemically inert. Two screening experiments were performed by using Ph.D.-C7C phage library. During the first screening, 3 biopanning and during the second screening, 4 biopanning were performed. By following the fact that biopanning, which is the main step in phage display, may have possible limitations. These limitations were tried to be overcome by using different novel approaches such as ultrasonication as a physical elution method and application of bound phage recovery are applied to elute the mica specific phages from the surfaces. These novel approaches are applied respectively to mica surface after completion of chemical elution in biopanning procedure. Sequence and amino acid based analysis of chemically eluted, chemically+sono eluted and bound phage recovered phages were compared with each other. Immunofluoresecent microscopy technique was used for the initial binding characterization and categorization of polypeptides as strong, moderate and weak binder according to their specificity and affinity. FM experiment using titanium powder was also performed only for the strong binders to analyze the specificity for mica surface. Results demonstrated that, ultrasonication and bound phage recovery method could be transformed phage display procedure into a more efficient method for the analysis of the inorganic binders.