Hücre Kültürü Modellerinde Mefv Geni Alternatif Kırpılmış Transkriptlerinin Ekspresyon Modellerinin Analizi

Abstract

Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA), bölgemizdeki görülme sıklığı 1/200 ila 1/1073 arasında olan otoenflamatuvar bir hastalıktır. Temel semptomları, periyodik olarak tekrarlanan ağrılı karın zarı, akciğer zarı, eklem sıvısı ve kalp dış zarı enflamasyonlarıdır. Bu ataklar sonucu “amiloid” denilen protein çökeltilerinin oluşma olasılığı yüksektir, tedavi edilmezse amiloid birikimi böbrek yetmezliğine bağlı olarak ölüme sebebiyet verebilir. FMF hastalığıyla ilintili olan gen MEFV olup FMF hastalarında bu genin 200’den fazla varyasyonu tanımlanmıştır. FMF hastalığının kalıtım modeli otozomal resesif olarak kabul edilmesine rağmen bazı durumlar baskın geçişli ya da bileşik heterozigot geçişli olarak raporlanmış olup, bazılarında hiç mutasyon gözlenmemiştir. MEFV geni enflamatuvar/regülatör gen olup “Pyrin/Marenostrin (P/M)” adı verilen bir proteini kodlar. P/M, pro-enflamatuvar elementlerle etkileşim halinde enflamazom kompleksinin bir parçasını oluşturarak enflamasyon yolizine dahil olur. Bununla birlikte MEFV geninin Behcet Sendromu, Crohn’s hastalığı ve gut gibi diğer otoenflamatuvar hastalıklarla da ilgili olduğu kanıtlanmıştır. Alternatif kırpılma, transkripsiyon aşamasında gen ekzonlarının farklı sıralarda birleştirilmesi sonucu aynı genden türetilmiş çeşitli protein izoformlarının oluşmasını sağlayan bir süreçtir. “Anlamsızlık aracılıklı yıkım (AAY)” adı verilen bir mekanizma ile birlikte alternatif kırpılma, gen ekspresyonu ve protein üretiminin düzenlenmesi ve çeşitli protein yapılarının evrilmesi süreçlerinin bir parçasıdır. Aynı genden üretilen çeşitli protein izoformlarından, hücre gelişim seviyesine göre işlevsel olmayan protein AAY aracılığıyla parçalanır. Hücrede bu mekanizmalar, ihtiyaç duyulan proteinin üretilmesinde düzenleyici olarak işlev görür. Kompleks hastalık patofizyolojilerinde önemli bir rol oynadığı düşünülen bu süreçler, aynı zamanda gelişimsel farklılaşma yolizlerinde de oldukça etkin bir rol üstlenir. Alternatif kırpılmanın kanser, Parkinson, Alzheimer ve Kistik fibrozis gibi hastalık patolojilerinde görülen moleküler etkileşimlerde önemli rolü bulunduğu bilinmektedir. MEFV geni transkriptleri çeşitli alternatif kırpılmış formlarda üretilmektedir. Özellikle lökositlerde ve eklem sıvısında en yaygın olarak gözlenen MEFV alternatif kırpılmış formları şunlardır: MEFV-8ext (8. ekzonun ek bir kısmını içeren izoform), MEFV-4a ( 5, 6, 7, 8, 9 ve 10. ekzonları içermeyen, 4. ekzonun bir kısmını içeren form), MEFV-2a (2. ekzonun bir parçasını içeren form) ve MEFV-2Δ (2. ekzonu içermeyen transkript). MEFV geninin 2. ekzonunun proteinin lokalizasyon tayininde önemli rol oynadığı düşünülmektedir. 2. ekzonun delesyonunun, ortamda nükleer lokalizasyon sinyalleri bulunmasına rağmen molekülün hatalı lokalizasyonuna yol açtığı bilinmektedir. Grubumuzca yapılan bir çalışmada da MEFV-2Δ izoformunun FMF hastalarında sağlıklı kontrollere göre daha yüksek oranda bulunduğu gösterilmiştir (p=0,026). Bu buluntular, enflamasyon yolizi ile MEFV-2Δ izoformunun ekspresyon seviyesi arasında bir bağlantı olasılığını işaret etmektedir. Gen ekspresyon seviyesi belirleme ve karşılaştırma çalışmalarında sıklıkla kullanılan yöntemlerden biri ters transkripsiyon - relatif kantitasyondur. Bu tip çalışmalarda, öncelikle örneklerden RNA izolasyonu yapılır ve RNA’dan, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile komplementer DNA sentezlenir. Komplementer DNA sentezi için rastlantısal primerler, “oligo-dT” primerleri veya hedefe özgü dizayn edilmiş primerler kullanılabilir. Bu üç yöntemden rastlantısal primerler ve oligo-dT primerleri, izole edilmiş RNA havuzu içinden herhangi bir RNA’ya bağlanarak hedef gözetmeksizin reaksiyon sonunda karışık bir komplementer DNA içeriği oluşmasını sağlarlar. Hedefe özgü primerler ise belirli bir RNA molekülüne bağlanarak özellikle bu RNA’ya ait bir komplementer DNA sentezini sağlarlar. Rastlantısal ve oligo-dT primerleri, tek reaksiyon ile birden fazla çeşitte komplementer DNA sentezine olanak verirken hedefe özgü primerler, bir reaksyonda tek tip komplementer DNA sentezini sağlar. Hedefe özgü primerler ile nadir olarak üretilen bir transkriptin tespiti sağlanabilir. Literatürde yer alan çalışmalarda, gen havuzu içinde nadir olarak üretilen transkriptlerin tespitinde hedefe özgü primerlerin daha doğru sonuç verdiği belirtilmiştir. Çalışmamızın temel hipotezi enflamatuvar yolizlerinde MEFV’in kesin rolünün belirlenmesidir. Enflamasyonda MEFV geninin rolünü anlamak için öncelikle insan primer lökosit kültüründe bir enflamasyon modeli tasarladık. Lökositleri aktive etmek için lipopolisakkarit (LPS) kullandık ve sonuç enflamatuvar sitokin seviyesini ölçtük. İlk buluntularımız primer kültür enflamasyon modelinde düşük sitokin seviyesini göstermekteydi. Bunun üzerine HL-60 premiyelotik hücre hattı hücrelerini kullanarak başka bir enflamasyon modeli hazırladık. Sonuç olarak Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) uygulanmış HL-60 hücrelerinin LPS ile uyarımı, proenflamatuvar bir sitokin olan İnterlökin 1-beta (IL-1β)’nın yüksek oranda üretimine yol açtı. Daha sonra, MEFV-2Δ üretimini atak dönemindeki AAA hastalarının eklem sıvısı ve kan örneklerindeki diğer transkriptlerle karşılaştırdık. Bunun için örneklerden RNA izolasyonunu gerçekleştirdikten sonra Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) yöntemini Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Q-RT PCR) yöntemi ile birlikte kullandık. MEFV-2Δ transkriptinin diğer RNA’lar içinde nadir üretilen bir ürün olması sebebiyle, ekspresyon profilinin doğru karşılaştırılabilmesi için iki farklı cDNA sentez stratejisi uyguladık. Bu stratejiler MEFV alternatif kırpılmış transkriptlerinden rastlantısal primerler ile komplementer DNA(cDNA) sentezi ve hedefe özgü primerler ile cDNA sentezi idi. Enflamasyon durumunu deneyin her bir basamağındaki enflamatuvar sitokinler pro-IL-1β ve Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α) üretimi seviyesiyle ve sağlıklı kontrollerle karşılaştırdık. Enflamasyon modelini PMA ve LPS uygulanmış hücrelerde başarı ile gerçekleştirdik. Ayrıca hedefe özgü primerler ile sentezlenen cDNA’lar ile rastlantısal primerlerle sentezlenmiş cDNA’lara göre daha doğru sonuçlar alınmıştır. Buna göre hedefe özgü primerlerle sentezlenmiş cDNAnın taslak DNA olarak kullanıldığı durumda, gerçek zamanlı PCR’da referansa göre belirlenen eşik değer floresan sinyalinin aşıldığı döngü sayısı (Ct) ortalama 25 iken rastlantısal primerle sentezlenmiş cDNA’nın taslak olarak kullanıldığı reaksiyonlarda bu değerler ortalama 40 olarak bulunmuştur. Sonuç olarak, enflamasyon durumunda diğer transkriptlerin ekspresyon seviyesinin düşmesine rağmen MEFV-2Δ transkriptinin ekspresyonunun arttığı gözlenmiştir (enflamasyon modelinde p=0,024, sinoviyal sıvı örneklerinde p=0,037). Bu artış, özellikle hedefe özgü primerlerle yapılan sentezlenmiş komplementer DNA karşılaştırmalarında belirgin olarak gösterilmiştir. Enflamasyon ile paralel olarak gözlenen MEFV-2Δ ekspresyon artışı akut FMF durumundaki hastaların sinoviyal sıvı ve kan örneklerinden alınan sonuçlarla doğrulanmış olup, MEFV-2Δ transkriptinin enflamatuvar yolizinde önemli bir rolü olabileceği hipotezi desteklenmiştir. Daha yüksek sayıda hasta örneklemesi ile MEFV-2Δ izoformu ve pyrin ile etkileşen proteinlerin tanımlaması çalışmanın daha sonraki basamakları için gereklidir.

Familial Mediterranean Fever (FMF) is an autoinflammatory disease of our region with a frequency of 1/200 to 1/1073. Main symptoms include periodicly recurrent fever attacks with painful inflammation in peritoneum, pleura, synovium and pericardium. These FMF attacks may result as amyloid formation and aggregation, if not treated, aggregation may lead to renal failure. The gene of FMF is MEFV, in which to date more than 200 variations were identified in patients. Although hereditary mode of inheritance of FMF was accepted as autosomal recessive, dominant or compound heterozygous cases as well as patients without any MEFV pathological mutations were identified. Furthermore there is evidence of MEFV involved in other inflammatory immune diseases such as Behcet syndrome, Crohn’s Disease and Gut. MEFV gene is an inflammatory/regulatory gene, codes for Pyrin/Marenostrin (P/M) protein. P/M is involved in inflammatory pathway through interacting with pro-inflammatory elements, forms a part of the “inflammasome” complex. Inflammasome assembled in the cytoplasm causes the secretion of proinflammatory cytokines and leads to inflammatory response. MEFV gene is transcripted in several alternatively spliced forms. The most common MEFV protein isoforms found in peripheral blood leukocytes and synovial fibroblasts are MEFV-8ext (additional extension of exon 8), MEFV-4a (lacking exon 5, 6, 7, 8, 9 and 10, with the addition of part of exon 4), MEFV-2a (with part of indicated exon) and MEFV-2Δ (exon 2 deleted transcript). Especially exon 2 is thought to be important in localization estimation. It was shown that, deletion of exon 2, leads to localization errors even if the localization signals exist in the environment . Previous study of our group indicated that MEFV-2Δ is expressed higher in FMF cases rather than healthy controls (p= 0.026) in total blood samples.These findings leaded to the assumption that there can be a connection between inflammatory pathway and MEFV-2Δ transcript levels. Our main hypothesis is to test the exact role of MEFV in inflammatory pathways. To understand the relationship, first we designed an inflammation model with primary human peripheral blood leukocyte (PBL) cell culture. We used lipopolysaccharide (LPS) induction to model inflammation and measured inflammatory cytokine levels. Our initial findings indicated a low cytokine levels in primary cell culture model. Therefore we constructed another inflammation model with HL-60 premyelocytic cell line cells. LPS induction of Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) treated HL-60 cells produced excess amount of proinflammatory cytokine interleukin 1-beta (IL-1β). We further compared MEFV-2Δ expression with oher alternatively spliced transcripts in synovial fluid and blood samples of FMF patients in their attack period. To do this, we isolated RNA molecules from the samples and applied Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) in combination with Quantitatvie Real Time PCR (QRT-PCR). Due to MEFV-2Δ’s being a rare product in all other RNA molecules, two different cDNA synthesis strategies were applied and compared to detect the accurate relative amounts of MEFV-2Δ and other MEFV transcripts. These strategies were cDNA synthesis with random priming and cDNA synthesis with target specific priming of MEFV aternatively spliced transcripts. We checked inflammation status with pro-IL-1β and TNF-α mRNA levels in each set up and we compared MEFV alternatively spliced transcript levels in stimulated versus untreated cells, additionally in synovial fluid and blood samples of FMF cases. We constructed inflammation model succesfully with LPS induction after phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) differentiation. Furthermore, target specific cDNA synthesis resulted more accurately than random primed cDNA synthesis. Ct values of randomly primed MEFV alternatively spliced form cDNAs were around 40, while target specifically primed cDNA Ct values were in interval of 20-25 especially in inflammation cases. In conclusion, our findings indicated that MEFV-2Δ is highly expressed in inflammation conditions (in inflammation model p=0.024; in synovial fluid samples p=0.037), and this transcript may have a putative function in inflammatory pathway and in FMF pathology.This result was confirmed with acute FMF synovial fluid and blood samples and the hypothesis of MEFV-2Δ transcript’s being important for inflammatory pathway was supported. Further studies are required in higher number of patients during attack and remission periods, as well proteins interacting with MEFV-2Δ isoform and fulllenght pyrin need to be identified.