Bag-1 In Susturulması Mcf-7 Meme Kanseri Hücrelerinde Sisplatin Ya Da Paklitaksel İle Tetiklenen Apoptozu Arttırmaktadır

Abstract

Çok fonksiyonlu apoptoz karşıtı Bag-1 proteini (Bcl-2 assosiye gen) hücre içerisinde önemli fonksiyonları olan nuclearhormone reseptörleri, Bcl-2 proteini, Hsp70/ Hsc70 ısı şok proten ailesi, büyüme hormone reseptörleri, Raf-1 serin/treoninkinaz ailesi gibi birçok molekül ile etkileşimde bulunmaktadır. Bu nedenle, Bag-1 hücre büyümesini ve proliferasyonunu, hücre sinyal yolaklarını ve apoptoz mekanizmasını düzenlemede rol almaktadır. Bag-1 proteinin hücre içerisinde farklı yerlede lokalize olan 3 izoformu bulunmaktadır. Bag-1L izoformu 50 kDa olup, nüklear lokalizasyon sinyali (NLS) sayesinde nukleusta konumlanmaktadır. Bag-1M izoformu 46 kDa olup nukleus ve sitoplazma arasında konumlanmaktadır. Bag-1S ise 36 kDa olup sitoplazmada lokalize olmuştur. Birçok kanser çeşidinde Bag-1’ın ekspresyon seviyesinde artış görülmektedir. Bu artış, Bag-1’ın etkileşimde bulunduğu moleküller ile gerçekleşmekte ve en önemli etkileşimini Bcl-2 ve Hsp70 ile göstermektedir. Bu sayede Bag-1 çeşitli stres faktörleri karşısında hücrelerin sağ kalımını arttırıcı etki göstermektedir. Kanser tedavilerinde klasik kemoterapötik ilaç uygulamaları uzun süredir kullanılmaktadır ancak kanser gelişiminde rol oynayan bazı genlerin geçici olarak susturulması ve protein ekspresyon seviyelerinin azaltılması ile hücreleri ölüme götürmeyi hedeflemek yeni uygulamalardan biridir. Bu yöntem ile hem ilaçların yan etkilerini azaltılmakta hem de hücrelerin ilaçlara karşı oluşturduğu resistans mekanizması ortadan kaldırılmaktadır. Bu nedenle çalışmamızda, Bag-1’ın geçici olarak susturulmasının MCF-7 hücrelerinde sisplatin ya da paklitaksel ile tetiklenenapoptotik mekanizmadaki rolü araştırılmıştır. Öncelikle zamana bağlı sisplatin ya da paklitaksel uygulamasının MCF-7 hücrelerinin sağ kalımını azalttığı MTT Hücre canlılığı testi ile gösterilmiştir. Her iki ilacın da Bag-1 ekspresyonunu azalttığı immünoblotlama ile gösterilmiştir. Bag-1’ın geçici olarak susturulmasının tüm izoformlar üzerinde etkili olduğu ve susturulmayı takiben uygulanan sisplatin ya da paklitakselin Bag-1 ekspresyonunu oldukça azalttığı immunoblotlama ile gösterilmiştir. Bunun yanında, Bag-1 siRNA uygulaması ile birlikte sisplatin ya da paklitakselin tetiklediği apoptozda, hücrelerin morfolojik olarak gösterdiği değişiklikler gösterilmiştir. Apoptozun önemli göstergelerinden olan DNA kırıklarının oluşumu, nüklear kondensasyon, mitokondri membran permeabilitesindeki azalma ya da apoptotik ve lizozomik vesiküllerin oluşumu PI, DiOC6, AO/EB ve DAPI boyaması ile gösterilmiştir. Pro-apoptotik ve anti-apoptotik Bcl-2 ailesi proteinlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişiklik sisplatin ya da paklitaksel uygulanan MCF-7 normal ve Bag-1 susturulmuş hücrelerde immünoblotlama ile gösterilmiş ve pro-apoptotik Bcl-2 ailesi proteinlerinin ekspresyon seviyelerinde artış gözlenirken, anti-apoptotik Bcl-2 ailesi proteinlerinin ekspresyon seviyelerinde azalma gözlenmiştir. Çoğu kanser tipinde mutasyona sahip olan tümör supressör p53 proteininin ve p53’ün hedef genlerinin ürünleri olan Puma ve Noxa proteinlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişiklik Bag-1’ın susturulduğu hücrelerde cisplatin ya da paclitaxel varlığında çalışılmıştır. Bunun yanında akım sitometrisi ile Bag-1’ın hücre siklusu üzerindeki etkisi araştırılmış ve Bag-1 susturulmasını takiben uygulanan ilaçların apoptoz göstergesi olan sub-G1 fazında artışa neden olduğu gösterilmiştir. Hücre siklusunda önemli görevleri olan siklinler ve sikline bağlı kinaz proteinlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişiklik incelenmiştir. Kullanılan cisplatin ya da paclitakselin, çeşitli kanser tiplerinde G2/M fazında hücre döngüsünde tutuklanmaya sebep oldukları bilinmektedir ancak Bag-1 siRNA hücre döngüsünde meydana gelen değişiklikler daha önce araştırılmadığı için, bu çalışmanın amaçlarından birisi olmuştur. Apoptoz yolağının en önemli parametrelerinden birisi olan kaspazların aktif hale gelmesi ve kaspaz yolağını aktive etmeleri cisplatin ya da paclitaksel uygulanan Bag-1 susturulmuş ve doğal tip hücrelerde zamana bağlı olarak araştırılmıştır. Zamana bağlı ilaç uygulamaları ile kaspazların kesilmiş formlarında artış gözlemlenmiş ve Bag-1 siRNA varlığında bu kesilmiş formların ekspresyon seviyelerinde artış gözlemlenmiştir. Bag-1’ın ekspresyon seviyesindeki değişimin hücrelerin büyümesi, canlılığı, proliferasyonu ve apoptoz mekanizması üzerinde farklı etkilere sahip olduğunun doğrulanması amacı ile Bag-1’ın geçici olarak susturulmasının yanında Bag-1L genine sahip plazmid vektör transfeksiyonu ile MCF-7 hücrelerinde Bag-1’ın stabil olarak ekspresyonu arttırılmıştır. Bag-1’ın ekspresyon seviyesindeki artışın hücrelerin sağ kalımında ve proliferasyonunda artışa neden olduğu belirlenmiş ve ekspresyon seviyesindeki bu artışın sisplatinya dapaklitaksel uygulamalarına karşı koruma meydana immünoblotlama ile gösterilmiştir. Bag-1 proteinin sisplatin ya da paklitaksel ile tetiklenen apoptoz mekanizmasındaki rolü Polyamin metabolizması ile ilişkilendirilerek araştırılmıştır. Hücrelerin canlılığının korunma, çoğalma ve büyüme mekanizmalarında rol oynayan poliaminleramin türevli organik bileşiklerdir. Birçok farklı kanser tipinde hücre içi poliamin miktarlarında artış gözlemlenmiştir. Putresin, spermidin ve spermin bu mekanizmalarda görev alan önemli poliaminlerdendir ve biyosentezleriOrnitinDekarboksilaz (ODC) enzimi ile kontrol edilirken, katabolik yolakları Poliaminoksidaz (PAO) ve Spermidin/spermin-N1-asetiltransferaz (SSAT) enzimi ile kontrol edilmektedir. Bag-1 aşırı ekspresyonuna sahip hücrelerde normal hücrelere kıyasla ODC ekspresyonu artış gösterirken, Bag-1’ın susturulmasının da katabolik enzimlerden PAO ve SSAT ekspresyonunda artışa sebep olduğu immunoblotlama ile belirlenmiştir. Poliamin yolağının yan ürünleri olarak açığa çıkan Reaktif Oksijen Türleri (ROS), Bag-1’ın susturulması ile artış göstermektedir. Özetle, bu çalışmanın en önemli amacı Bag-1’ın susturulmasını takiben uygulanan ilaçlar varlığında tetiklenen apoptotik mekanizmasının farklı parametreler ile gösterilmesidir. Bunun için kullanılan parametler, apoptozun hangi yoldan ilerlediği, bunun için hangi protein ya da protein ailelerine bağlı kaldığını açığa çıkarmaktadır. Kanser hücrelerinin apoptoza yönelmesinde ilaç uygulamalarının yan etkilerini ortadan kaldırmaya yönelik olarak geliştirilen yeni çalışmalarda Bag-1 siRNA’ nın potansiyel kullanımını arttırmak amaçlanmaktadır.

The multifunctional anti-apoptotic Bag-1 (Bcl-2 athanogene) protein has several interaction partners, such as nuclear hormone receptors, anti-apoptotic Bcl-2 protein, Hsp70/Hsc70 heat shock protein family, growth hormone receptors, Raf-1 serine threonine kinase family, that have important roles in cell involving the regulation of cell survival, cell proliferation, cell signalling and apoptosis. Bag-1 protein consists of three different isoforms produced by alternative translation from the same mRNA. Bag-1L (50 kDa) is the least expressed isoform of Bag-1 and localized in the nucleus due to its Nuclear Localization Signal (NLS). Bag-1M (46 kDa) partitions betweenthe nucleus and the cytoplasm.Bag-1S (36 kDa) is the most expressed isoform of Bag-1 localized in the cytoplasm. Elevated levels of Bag-1 expression were observed in various cancer cells, thereby, linking the overexpression of Bag-1 with the development of cancer. The most striking interactions of Bag-1 are with Bcl-2 and Hsp 70. These interactions of Bag-1 can enhance the survival potential of cancer cells against stress conditions. Classical chemotherapeutic drugs has been used for many years for the treatment of various cancer types, but the downregulation of some genes that have roles in cancer development represents a new approach to enhance the cell death mechanism. By this way, the side effects of drugs or resistance to drugs can be minimized. With this motivation, we decided to examine the effects of Bag-1 silencing in cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 cells. We determined that cisplatin and paclitaxel decreased the cell viability of MCF-7 cells in a time and dose dependent manner, as confirmed with the MTT cell viability assay. Therefore, both drugs were used to induce apoptosis in MCF-7 cells. We showed that silencing of Bag-1 was effective to downregulate all Bag-1 isoforms, and cisplatin or paclitaxel treatment following Bag-1 silencing abolished the Bag-1 expression whichwas investigated by immunoblotting analysis. We determined the effect of cisplatin or paclitaxel and/or Bag-1 silencing in cell proliferation or cell death mechnanisms of MCF-7 cells by trypan blue dye exclusion assay and apoptotic cell death Elisa assay. The most important features of apoptosis are DNA fragmentation, nuclear condensation, cell shrinkage, mitochondrial membrane permeabilization loss andmembrane blebbing. We observed these signs of apoptosis in cisplatin or paclitaxel and/or Bag-1 siRNA treated MCF-7 cells by propidium iodide (PI), DiOC6, acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) and DAPI staining. The role of Bag-1 silencing in cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis was investigated by comparing the expression levels of anti-apoptotic and pro-apoptotic Bcl-2 family members usingimmnublotting assay. It was observed that each drug was effective to downregulate the anti-apoptotic Bcl-2 family members (Bcl-2 and Bcl-xL) and upregulate the pro-apoptotic Bax, Bak, Bid, Bad, Noxa and Puma expression, and silencing of Bag-1 enhanced these effects. Cell cycle machinery was analyzed by flow cytometer to observe the apoptotic functions of drugs and/or Bag-1 siRNA and it was found that Bag-1 silencing caused the accumulation of sub-G1 phase which is indicative of apoptotis. To confirm that Bag-1 expression level was important for cell proliferation, cell survival or apoptotic mechanism, MCF-7 cells were transfected with human specific Bag-1L plasmid and stable colonies were selected. We examined that Bag-1L overexpression upregulated Bag-1 isoforms, enhanced the cell proliferation potential and decreased the apoptotic potential of both drugs was investigated by immunoblotting and cell death Elisa assay. The functional role of Bag-1 in cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis in association with polyamine signaling pathway was investigated in polyamine (PA) metabolism. Elevated intracellular polyamines are generally proposed as a final consequence of deregulated polyamine metabolism in cancer cells. Polyamines; putrescine, spermidine and spermine, are regulated by the biosyntheticornithine decarboxylase (ODC) enzyme and catabolic polyamine oxidase (PAO) and Spermidine/spermine-N1-acetyltransferase (SSAT) enzymes. However, overexpression of Bag-1 led to upregulation of ODC levels, silencing of Bag-1 caused the upregulation of PAO and SSAT levels. In addition, silencing of Bag-1 increased the generation of byproducts of PA metabolism, Reactive Oxygen Species (ROS), on during cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis.