Oksijen Deteksiyonu Temelli Lakkaz Biyosensörleri Yapımı

Abstract

Sanayinin son yıllarda hızlı bir şekilde gelişmesi, çeşitli sanayi yan ürünlerinden kaynaklanan çevre kirliliğine neden olmaktadır ve bunların en önemlilerinden biri olan fenolik bileşikler atıksuların kontrolsüz deşarjı ve sızıntılar sonucunda çevreye salınmaktadır. Fenol bileşiklerin hızlı biçimde tespit edilebilmesi ve miktarının belirlenmesi, çevrenin korunması ve kontrol edilebilmesi için büyük önem taşır. Fenolik bileşiklerin tayininde kullanılan geleneksel tayin teknikleri genellikle çok zaman alır ve işlem süreci pahalıdır. Ayrıca bu yöntemler ile bileşiğin tespiti yerinde yapılamamakta ve analizi yapacak olan kişinin eğitim almış olması gerekmektedir. Bu dezavantajları kaldırmak için fenolik bileşiklerin tespitinde alternatif yollar araştırılmaktadır. Bu alternatif yolların en önemlisini de enzim biyosensörlerdir. Bu çalışmanın amacı toksik fenolik bileşiklerin tespit edilmesinde geleneksel yollara alternatif, Trametes versicolor veya Pleurotus ostreatus (mantar)’dan izole edilmiş lakkaz enzimini kullanarak ucuz, taşınabilir ve kullanımı kolay bir biyosensör inşa etmektir. Bu amaç doğrultusunda iki farklı biyosensor düzenlendi. İlk biyosensor çevirici olarak klasik bir oksijen elektrod ünitesi (oxygraph) kullanılarak ve klasik jelatin hapsetme metoduna göre inşa edildi. Bunun için, Trametes versicolor’dan elde edilen lakkaz, sıcak su banyosu içerisinde eritilmiş olan jelatin içerisine koyuldu ve bu karışım PTFE yüzeyine aktarıldı. Bu sayede enzimin jelatin yapı içerisinde hapsedilmesi sağlandı. Hapsetme işleminden sonra yapının donması beklendi ve ardından üzerinde enzim ve jelatin bulunan PTFE örnekleri içerisinde gluteraldehit (GA) bulunan tüplerde tutuldu. Böylelikle jelatinin PTFE yüzeyine çapraz bağlanması yani immobilizasyonu sağlandı. Ardından, PTFE yapıları ölçümler yapılıncaya kadar o4 C’de bekletildi. Ölçümler sırasında katekol ve klorofenol substratları kullanılarak biyosensörün çalışabildiği optimum çapraz bağlayıcı derişimi, sıcaklık ve pH değerleri belirlendi. Optimum gluteraldehit yüzdesini bulmak için bazı biyosensör örnekleri PTFE yüzeyine tutturulduktan sonra 2.5% gluteraldehit ile reaksiyona sokulurken; bazıları da 5% gluteraldehit ile reaksiyona sokuldu. Optimum gluteraldehit yüzdesi tespitinden sonra biyosensörün çalıştığı en iyi pH değeri belirlendi. Bu aşamada 2.5% gluteraldehit kullanılarak immobilize edilmiş örnekler kullanıldı. Daha sonra tek bir örneğin sırasıyla 4.0-4.5-5.0-5.5-6.0-6.5-7.0 pH değerlerine sahip tampon çözeltilerindeki aktiviteleri hesaplandı. Optimum gluteraldehit yüzdesi ve pH’nın belirlenmesinden sonra biyosensörün çalıştığı en iyi sıcaklık değeri belirlendi. Deneyin bu aşamasında ilk olarak sensörler 2.5% gluteraldehit kullanılarak immobilize edildi. Daha sonra tek bir örneğin sırasıyla 25-30-35-40-45-50 oC sıcaklığa sahip tampon çözeltisindeki aktivitesi belirlendi. Elde edilen aktivite değerlerinin karşılaştırılması sonucunda biyosensörün katekol ve klorofenol substratlarına karşı çalıştığı en iyi sıcaklık ve pH değeri belirlendi. Yapılan deneyler sonucunda jelatin içerisine tutuklanmış lakkaz yapısından oluşan biyosensörün çalışabildiği optimum gluteraldehit yüzdesi 2.5% olarak bulundu. Bu sonuca elde edilen aktivite değerleri, biyosensörün tepki süresi ve jelatinin PTFE membranından ayrılma süresi incelenerek ulaşıldı. Deneyler sonucunda elde edilen diğer bir veri ise; 2.5% gluteraldehit solüsyonunda hazırlanmış lakkaz biyosensörünün katekol ve klorofenol substratları için aynı sonuçları vermiş olmasıdır. Her iki substratta da biyosensörün çalışabildiği optimum sıcaklık derecesi 35 oC ve optimum pH değeri 5 olarak tespit edildi. Deneyin bir diğer sonucu ise, biyosensör ile optimum koşullar altında üst üste 10- 20 ölçümün yapılabilmesidir. Ayrıca, daha yüksek aktivite değerleri tespit edildiğinden ve reaksiyonun daha kısa sürede gerçekleşmesinden dolayı lakkaz biyosensörünün karakterizasyonu için katekolün klorofenole göre daha uygun substrat olduğu gözlemlenmiştir. Bu nedenle fiber optik biyosensör ile çalışılırken substrat olarak sadece katekol kullanılmıştır. İkinci biyosensör fiberoptik bir sistemdir ve ilk biyosensörden immobilizasyon yöntemi ve kullanılan kimyasallar bakımından farklıdır. Fiber optik biyosensörde, Pleurotus ostreatus’dan elde edilen lakkaz enzimi kullanıldı ve bu enzim, içerisinde florofor bulunan fiberoptik oksijen sensorleri üzerine kovalent bağlanma yöntemiyle immobilize edildi. İmmobilizasyon sırasında 3-aminopropilsilantriol (APST) yüzey aktifleyici, gluteraldehit (GA) çapraz bağlayıcı ve amino modifiye edilmiş karboksisellüloz (AMC) mekanik sabit matriks oluşturucu olarak kullanıldı. Enzimin immobilizasyonundan sonra, enzim tabakasının üzerine koruyucu görev sağlaması için difüzyon tabakası ilave edildi. Bu tabaka sayesinde enzimin dış etkenlerden korunması, enzime düzenli bir şekilde substrat ulaşması ve reaksiyon sonucu oluşan ürünlerin düzgün biçimde ortamdan ayrılabilmesi sağlandı. Difüzyon tabakasının esnek olması ve enzim tabakasıyla bağ yapabilmesi için TMOS ve Tri-MOS kimyasalları kullanıldı. Oluşturulan biyosensörler ölçümler yapılıncaya kadar o4 C’de bekletildi. Ölçümler sırasında ilk olarak biyosensörün optimum hazırlanma ve çalışma koşulları (enzim miktarı, difüzyon tabakası sayısı, pH) incelendi. Optimum enzim miktarının tespiti için üç farklı enzim miktarı içeren üç farklı sensör hazırlandı. Faz açısı değerlerinin ve sensörlerin tepki zamanların karşılaştırılması sonucunda optimum enzim miktarı belirlendi. Optimum enzim miktarı belirlendikten sonra optimum difüzyon tabakası sayısı araştırıldı. Bu amaç doğrultusunda bazı sensörler difüzyon tabakasısız, bazıları bir difüzyon tabakalı, bazıları da iki difüzyon tabakalı şekilde hazırlandı ve ölçümler yapıldı. Optimum hazırlanma ve çalışma koşullarının belirlenmesinde son adım olarak optimum pH değeri incelendi. Hazırlanan sensörlerin farklı pH değerine sahip tampon çözeltileri içerisinde gösterdikleri aktivite değerleri ve tepki süreleri karşılaştırılarak sensörlerin çalıştığı optimum pH değeri belirlendi. Optimum çalışma koşulları belirlendikten sonra biyosensörün performans değerleri araştırıldı. Bu doğrultuda biyosensörün tekrarlanabilirliği, tepki süresi, ölçüm süresi, dinamik aralığı, saklama stabilitesi araştırıldı. Tüm bu parametrelerin belirlenmesi sırasında kullanılan sensörlerin yapımında optimum enzim miktarı ve difüzyon tabakası sayısı kullanıldı. Ayrıca ölçümler optimum pH değerinde gerçekleştirildi. Performans değerleri belirlendikten sonra sensörlerin farklı sistemlere uygulanabilirliği araştırıldı. Bu doğrultuda ilk olarak biyosensör devirdaim yapan sistemlere uygulandı. Devirdaim yapan sistemler sayesinde biyosensörün aralıksız şekilde ölçüm yapması hedeflendi. Diğer bir uygulama alanı olarak da 24 kuyucuklu plateler kullanıldı. Bu plateler sayesinde her bir plate kuyucuğu ufak bir biyoreaktör olarak düşünüldü ve aynı anda pek çok farklı parametrenin bu sistemde incelenebilirliği araştırıldı. Karakterizasyonu ve optimizasyonu yapılan biyosensör ile son olarak gerçek örneklerin (elma suyu ve farklı çeşitlerde çay) fenolik bileşik konsantrasyonları incelendi. Fiber opitk biyosensör ile yapılan tüm deneylerde substrat olarak katekol kullanıldı. Yapılan deneyler sonucunda optik biyosensörün optimum enzim miktarı, difüzyon tabakası sayısı ve pH değeri sırasıyla 1.5 mg, 1 ve 6.9 olarak belirlendi. Bu değerler biyosensörün optimum çalışma koşulları olarak kaydedildi ve ardından, sensörün performans değerleri araştırıldı Bu doğrultuda biyosensörün dinamik aralığı 0.04-0.6 mM, tepki süresi birkaç saniye ve ölçüm süresi ortalama 13 dakika bulundu. Yapılan ölçümlerden sonra sistemin yenilenme süresi de ortalama 12 dakika olarak hesaplandı. Buna ilaveten, sensörlerin saklama stabilitesi en az 85 gün ve sensörlerin yeniden üretilebilirliği oldukça yüksek olarak tespit edildi. Ayrıca sensörlerin tepkilerinin tekrarlanabilirliği de oldukça yüksek şekilde gözlemlendi. Sensörlerin uygulanabilirliği ilk olarak devirdaim yapan sistemde denendi ve deney sonuçlarına göre sensörlerin devirdaim yapan sistemlere uygulanabilir olduğu gözlemlendi. Diğer bir uygulama alanı olarak da 24 kuyucuklu plate kullanıldı ve sensörlerin bu sisteme uygulanabilirliğinin düşük olduğu görüldü. Elde edilen sonuçların her defasında farklı olması ve sensörlerin kısa sürede parçalanması bu sonuca neden olmuştur. Son olarak, sensörlerin meyve suları ve çay gibi gerçek örneklerde bulunan fenolik bileşik konsantrasyonun tespitinde etkili biçimde kullanılabildiği gösterildi. İki biyosensör sistemi de, özellikle fiber optik sistem, fenolik bileşik tespiti için ideal performans göstermiştir. Biyosensölerle yapılan deneyler sonucunda elde edilen verilere göre biyosensörlerin tekrarlanbilirlik sonuçları, tepki süreleri ve farklı konsantrasyondaki fenolik bileşikleri ayırt edebilme özellikleri biyosensörlerin fenolik bileşik tayininde kullanılabilirliğini göstermektedir. Fiber optik sistemin oksijen elektrod ünitesi ile kıyaslandığında daha kesin sonuç vermesi ve daha düşük konsantrasyondaki fenol bileşiklerini tespit edebilmesi nedeniyle daha sonraki deneylerde sadece fiber optik sistemin kullanılması düşünülmektedir. Bu doğrultuda ilk olarak fiber optik biyosensörün katekol dışındaki diğer fenolik bileşiklere olan tepkisinin incelenmesi planlanmaktadır. Böylelikle biyosensörün birden fazla fenolik bileşiğe tepkisi anlaşılabilecektir ve doğada kompleks halde bulunan fenolik bileşiklerin tayini daha kesin biçimde yapılabilecektir. Fiber optik biyosensör ile daha sonra yapılması planlanan deneylerde farklı gerçek örneklerle çalışılması düşünülmektedir. Böylelikle biyosensörün sebze ve meyvelerin içerisinde bulunan fenolik bileşiklerinin tayininde ve bu değerlerin ideal aralıkta olup olmadığının tespitinde kullanılması düşünülmektedir. Bu duruma ilaveten, çevre atık suların ve toprak kirliliği gerçekleşmiş yerlerin fenolik bileşik oranının tespitinde de kullanılması düşünülmektedir. Bu sayede çevre kirliliğine neden olan fenolik bileşiklerin kısa sürede yerinde tespiti sağlanabilecektir. Tüm bu deneylerin dışında ayrıca fiber optik sensörlerin uygulanabilirliğinin geliştirilmesi planlanmaktadır. Bunun için ilk olarak devirdaim yapan sistemin karakterizasyonu üzerine çalışılmalıdır. Bunun için devirdiam yapan sistemin dinamik aralığı, reaksiyon süresi ve saklama stabilitesi gibi performans faktörleri incelenmelidir. Öte yandan, diğer bir uygulama alanı olarak düşünülen 24 kuyucuklu platelerin ilk olarak optimizasyonu yapılmalıdır. Bu amaç doğrultusunda bu sistemlerin çalışabildiği optimum enzim miktarı, difüzyon tabakası sayısı ve pH değeri belirlenmelidir. Bu değerlerin belirlenmesinden sonra sistemin performans faktörleri araştırılacaktır.

Industrial developments have led to environmental pollution by many varieties of industrial by-products and phenolic compounds are one of the most important members of these by-products which are being released to the environment as a result of uncontrolled discharge or leakage of wastewaters. Rapid identification and quantification of phenolic compounds, is very important for efficient environmental protection and control. Traditional chromatographic methods used for determination of phenolic compounds are usually time consuming and expensive. Moreover, these methods do not allow on-site detection and need trained personnel. To remove these disadvantages, alternative ways, mainly enzyme biosensors, have been investigated in the determination of phenolic compounds. The aim of this study is to construct a biosensor from laccase enzyme, which was isolated from Trametes versicolor or Pleurotus ostreatus (mushroom), as a portable, cheap, easy-to-use alternative to known traditional methods for detecting toxic phenolic compounds. For this purpose, two different biosensors were constructed. The first one was based on a classical oxygen electrode unit (oxygraph) as a transducer and constructed according to a conventional gelatin entrapment method. Laccase from Trametes versicolor was entrapped in gelatin by glutaraldehyde (GA) crosslinking and immobilized on PTFE membranes. Optimum cross linker concentration, temperature and pH values for biosensor were determined using catechol and chlorophenol as substrate. Optimum glutaraldehyde concentration was found as 2.5% and optimum temperature and pH was established at 35 °C and 5, respectively for both catechol and chlorophenol. Another finding was that 10-20 consecutive measurements under optimum conditions could be done with the biosensor. It was observed that catechol was a better substrate than chlorophenol for laccase biosensor because higher laccase activity was determined in a shorter reaction time. Therefore, only catechol was used as a model substrate while working with the second biosensor. Second biosensor was based on a fiber optic system and was completely different from previous biosensor in terms of immobilization method and chemicals used. In this biosensor, laccase from Pleurotus ostreatus was immobilized on fiber optic oxygen sensor spots with a simple method that uses 3-aminopropylsilantriol (APST) for surface activation; GA as cross-linker and amino modified carboxycellulose (AMC) to form a mechanically stable matrix. Thereafter, biosensor’s optimum construction and working conditions (enzyme amount, diffusion layer quantity, pH value) and performance factors (reproducibility, response time, measurement period, repeatability of biosensor response, dynamic working range, storage stability and applicability to different systems such as flow through systems or sensor dishes) were investigated while catechol was used as a substrate. Moreover, phenolic compound concentration in real samples (apple juice and different sort of tea) was investigated. For the optical biosensor, optimum enzyme amount, diffusion layer number and pH value was determined as 1.5 mg, 1 and 6.9, respectively. Dynamic working range of biosensor was 0.04-0.6 mM (for catechol), response time was within seconds and measurement period was ca. 13 min. In addition, storage stability of the sensors was at least 85 days and reproducibility of sensors was very high. Our sensors were applicable to flow through systems and sensor dishes. Finally, sensors were shown to be effectively used for phenolic compound detection of real samples like fruit juices and tea.