Bacillus Subtilis Te Bulunan Yeni Sporulasyon Geni Yvgw Nun Karakterizasyonu

Abstract

Gram pozitif bakteri olan Bacillus subtilis, metabolizmasının iyi bilinmesi ve gelişimle ilgili olarak basit bir sisteme sahip olması nedeniyle, sporulasyon araştırmaları için örnek model organizma olarak seçilmiştir. Bacillus subtilis’de sporulasyon günümüzde oldukça iyi açıklanmış olmasına rağmen, genom dizileme çalışmalarının ardından, sporulasyonu etkileyen ama fonksiyonu tanımlanmamış genler olduğu tespit edilmiştir. Bacillus subtilis’ te bulunan yvgW geninin inaktif edilmesiyle, organizmanın sporulasyon seviyesinin belirgin şekilde düştüğü belirlenmiştir (Yazgan et al., 2001). Öte yandan, yvgW geninin Bacillus subtilis’ te Cd+2 dirençliliği ile ilgili bir fonksiyonunun olduğu belirlenmiştir (Solovieva and Entain, 2002, Gaballa and Helmann, 2003). Ayrıca, yvgW geni, Zn+2 ve Cd+2 varlığında indüklenen ikincil tip taşıyıcı olan CPx tip ATPaz olarak tanımlanmıştır (Gaballa and Helmann, 2003). Bu bilgilere dayanarak, yvgW geninin ifade edilme zamanını belirlemek için, Bacillus subtilis’ e özgü bir vektör olan pMUTINT3’ deki lacZ işareretçi genine füsyon yapılarak, yvgW::lacZ transkripsiyonel füsyonu oluşturuldu. Bunu takiben, yvgW::lacZ transkripsiyonel füsyonu Zn+2 ve Cd+2 ile indüklenerek and -galactosidaz aktiviteleri ölçüldü. Zn+2 ve Cd+2 ile indüklemesine ek olarak, -galaktosidaz miktarı büyüme ve sporlanma boyunca takip edilerek yvgW geninin ifade edilme zamanı belirlendi. Daha sonra, hangi sigma faktörün yvgW geninin ifade edilmesiyle ilişkisi olduğunu bulmak için, yvgW::lacZ füzyonunu taşıyan mutant suşun sigma G’ si, double kross-over’ la çıkarılarak sigma G’ nin yvgW geninin ifade edilmesi üzerine etkisine bakıldı.

The gram-positive bacterium Bacillus subtilis stands as the primary model organism for the research of sporulation process since its metabolism is well understood and it has a simple developmental system. Although this process is well defined in Bacillus subtilis up to now, following the genome sequencing studies, it has been found out that there are still some unrevealed genes with unknown functions affecting the sporulation processes. The inactivation of yvgW gene in Bacillus subtilis, has been reported to affect the sporulation level in this organism causing a dramatic decrease (Yazgan et al., 2001). On the other hand, it was determined that yvgW to have a function related to Cd2+ resistance through efflux of this metal in Bacillus subtilis (Solovieva and Entain, 2002). Moreover, yvgW was described as a secondary transporter, CPx-type ATPase that was induced with the existence of Zn+2 and Cd+2 (Gaballa and Helmann, 2003). Based on these facts, yvgW::lacZ transcriptional fusion for determining the time pattern of the yvgW gene expression was constructed via Bacillus subtilis specific vector pMUTINT3 that involves lacZ reporter gene leading to a gene fusion. Following this, yvgW::lacZ transcriptional fusion was induced with Cd+2 and Zn+2, and -galactosidase activities were measured. Later, expression time of yvgW gene was determined during growth and sporulation by -galactosidase assay. After this, another mutant strain carrying yvgW::lacZ fusion in which sigma G was deleted through a double cross over, was constructed and the effect of sigma G deletion on yvgW gene expression was determined in order to specify which sigma factor was related with yvgW gene expression.