Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/11527/3661
Title: Tanı Amaçlı Nano Boyutlu Algılayıcı Moleküller Olarak Dna Oligomerleri Ve Aptamerleri
Other Titles: Novel Dna Oligomers And Aptamers Based Sensing Molecules For Diagnostics
Authors: Tamerler, Candan
Mozioğlu, Erkan
10029118
Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji
Molecular Biology and Genetics
Keywords: Tanı
oligomer
aptamer
M.tuberculosis
nükleaz
enzim
Diagnosis
oligomers
aptamers
M.tuberculosis
nuclease
enzyme
Issue Date: 28-Feb-2014
Publisher: Fen Bilimleri Enstitüsü
Institute of Science and Technology
Abstract: Bu çalışmada DNA tabanlı moleküler yaklaşımlar üç farklı uygulama altında ele alınmıştır: Kalıtım birimleri olarak DNA moleküllerinin tanı amacıyla kullanılması, DNA oligomerlerinin tanı amacıyla kullanılması, DNA aptamerlerinin tanı amacıyla kullanılması. DNA molekülleri, kalıtım birimleri olup moleküler biyoloji, genetik ve biyoteknoloji ile ilgili pekçok alanda çok farklı amaçlarla kullanılmaktadır. Bunlardan biri, DNA moleküllerinin tanı amacıyla kullanılmasıdır. DNA molekülleri, canlılar arasındaki akrabalık ilişkilerinin belirlenmesinde, hastalık yapıcı mikroorganizmaların saptanmasında, hastalık genlerinin belirlenmesinde, genetiği değiştirilmiş organizmaların teşhisinde ve suçla ilgili araştırmalarda hedef olarak kullanılmaktadır. Bütün bu ve buna benzer amaçlar için, yaygın olarak, polimeraz zincirleme tepkimesi tekniğinden yararlanılmaktadır. Polimeraz zincirleme tekniği, DNA moleküllerinin, özel koşullar altında ve tekrarlanan döngülerle çoğaltılması esasına dayanmaktadır. Bu teknikte, kullanılan DNA polimeraz enziminin verimli bir şekilde çalışabilmesi için, en uygun kimyasal ve fiziksel şartların sağlanması gereklidir. DNA polimeraz enziminin substratı olan DNA molekülleri, canlılardan, çeşitli teknikler veya yöntemler kullanılarak saflaştırılmakta ve ardından polimeraz zincirleme tepkimesine sokulmaktadır. Dolayısıyla, tepkimenin sonucu, eklenen DNA moleküllerinin saflığı ile doğrudan ilgilidir. Saflaştırma adımları sırasında oluşan safsızlıklar veya elde edilen DNA moleküllerinin kopya sayısının düşük olması ya da DNA moleküllerinin niteliğinin iyi olmaması polimeraz zincirleme tepkimesinin kötü sonuçlanmasına neden olabilmektedir. İstenmeyen çoğalma ürünlerinin oluşması, çoğalmanın meydana gelmemesi veya çoğalmanın zayıf olması bu olumsuzluklardan bazılarıdır. Normal koşullarda, polimeraz zincirleme tepkimesinde, kuramsal olarak, her döngü sonrasında, DNA moleküllerinin sayısı iki kat artmaktadır. Ancak bu durum, polimeraz zincirleme tepkimesinin fiziksel ve kimyasal koşulları ile değişebilmektedir. Dolayısıyla, canlılardan, yüksek verimlilikte ve saflıkta DNA molekülü elde edilebilmesinde kullanılabilecek tekniklere veya yöntemlere gereksinimler bulunmaktadır. Bu amaçla, günümüzde, geliştirilmiş pekçok geleneksel yöntem ve genellikle bu esaslara dayalı ticari ürünler mevcuttur. Bunlardan en yaygın olarak kullanılan geleneksel yöntemler, kaynatma, dondurup çözme ve guanidinyum isotiyosiyanat temelli yöntemlerdir. Bu yöntemlerden özellikle kaynatma ve dondurup çözme yönteminde, DNA molekülleri kırılabilmekte ve saflaştıma adımlarının olmayışı nedeniyle elde edilen DNA moleküllerinin safsızlıkları yüksek olabilmektedir. Guanidinyum isotiyosiyanat temelli yöntemler ise, moleküler biyoloji laboratuvarlarında bulunan yaygın kimyasallarla gerçekleştirilen bir yöntem olmakla beraber DNA moleküllerinin saflaştırılması sırasında, fenol, kloroform gibi bazı zararlı kimyasalların kullanımını gerektirebilmektedir. Bütün bunların yanı sıra, DNA saflaştırmasında kullanılmak üzere geliştirilmiş ticari ürünler hem yüksek saflıkta hem de yüksek verimlilikte DNA molekülünün elde edilmesini sağlamaktadır. Bu ürünler, başarılı sonuçlarına karşın geleneksel yöntemlere göre daha pahalı olmaları nedeniyle her laboratuvar tarafından tercih edilememektedir. Bu sebeplerle, pekçok laboratuvarda mevcut olan kimyasalların kullanıldığı, zararlı kimyasalların kullanımına gereksinim duyulmayan, hızlı ve özellikle de ticari ürünler ile karşılaştırılabilir düzeyde yüksek saflıkta ve verimlilikte DNA moleküllerinin elde edilmesini olanaklı kılabilecek yeni yöntemlere gereksinimler bulunmaktadır. Bu noktadan hareketle, bu tez çalışması kapsamında, bakterilerden genomik DNA saflaştırılmasında kullanılabilecek, guanidinyum isotiyosiyanat temelli yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yeni yöntem kullanılarak Salmonella ser. Typhimurium, Escherichia coli ve Staphylococcus aureus bakterilerinden elde edilen genomik DNA’ların, kaynatma, dondurup-çözme gibi geleneksel yöntemlerden çok daha yüksek verimlilikte, bazı ticari ürünlerle kıyaslandığında ise karşılaştırılabilir düzeyde bir verimlilikte olduğu belirlenmiştir. Kalıtım birimleri olarak DNA moleküllerine dayalı moleküler yaklaşımlardan başka yapay DNA molekülleri ile de pekçok uygulama mevcuttur. Bu yapay DNA molekülleri, genellikle, kısa DNA molekülleridir ve DNA oligomerleri olarak anılmaktadır. Bu moleküller, özellikle, nanobiyoteknoloji ve moleküler biyoloji ile ilgili alanlarda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Mikron düzeyindeki küçük araçlar üzerine tutundurulan DNA oligomerleri, çeşitli hastalıkların tanısında, araştırmacılara, çok büyük katkılar sunmaktadır. Bunlardan başka, polimeraz zincirleme tepkimesinin gerçekleştirilebilmesinde, bu DNA oligomerlerinden yararlanılmaktadır. Bu moleküller, çoğaltılacak kalıp DNA moleküllerinin belirli bölgeleri ile eşlenik olan kısa DNA molekülleridir ki primer olarak tanımlanmaktadır. Günümüzde yaygın olarak tanı amacıyla kullanılan polimeraz zincirleme tepkimesi, bu DNA oligomerleri veya primerlerinin kullanımına bağlıdır; böyle olduğu düşünüldüğünde, DNA oligomerlerinin, moleküler tanıdaki önemleri ve yaygınlıkları daha iyi anlaşılabilir. Bununla birlikte, polimeraz zincirleme tepkimesinin daha gelişmiş bir uygulaması olan gerçek zamanlı polimeraz zincirleme tepkimesi deneylerinde, kimyasal yapısı değiştirilmiş DNA oligomerleri kullanılmaktadır ki bunlara prob denilmektedir. Problar, kovalent olarak floresan veya sönümleyen moleküller takılmış DNA oligomeleridir ve bunlar DNA moleküllerinin, polimeraz zincirleme tepkimesi sırasındaki çoğaltımının eş zamanlı olarak izlenebilmesini olanaklı kılmaktadır. Bu da DNA moleküllerinin, sadece nitel değil aynı zamanda nicel tanısında, polimeraz zincirleme tepkimesinin kullanılabilir hale gelmesine yardım etmektedir. Bunlar, özellikle ilaç araştırmalarında veya ilaca dirençli genlerin tanısında önemli olanaklar sunmaktadır. Bütün bunların yanı sıra, kovalent bağlı floresan ve sönümleyici moleküller takılı DNA oligomerleri, DNA nükleaz (DNAz) enzimlerinin etkinliklerinin belirlenmesinde substrat olarak kullanılabilmektedir. Özel tasarımları sayesinde, floresan ve sönümleyen moleküllerin yan yana gelmesine imkan verecek şekilde üç boyutlu yapı kazanan DNA oligomerleri, DNA nükleazlarının etkinlikleri sonucu kesildiklerinde, birbirlerine yakın duran floresan ve sönümleyen moleküller birbirlerinden uzaklaşmaktadır. Bu sayede, yan yana bulunduklarında sahip oldukları düşük floresans sinyal, kesim sonrasında artmaktadır. Bu sinyal artışı, enzim etkinliğinin belirlenmesinde kullanılmaktadır. Bilimsel makalelerde yer alan bu modele ek olarak diğer bazı araştırmacılar, kovalent bağ ile bağlanmış tek bir floresan molekülün kullanıldığı, ancak ek olarak, enzim kesimi sonrasında floresans sinyalin artışını sağlayabilmek için özel katyonik polimerlerin kullanılmasını gerektiren bir model önermişlerdir. Bu iki modelden farklı olarak, bu tez çalışmasında, kovalent olarak bağlanmış bir floresan molekül takılı DNA oligomerlerini kullanarak, sönümleyici başka bir moleküle veya floresans sinyalin artışını sağlayacak özel bir polimere gereksinim duymaksızın, DNAz etkinliğini belirleyecek duyarlı, hızlı, yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yeni yöntemde, DNA oligomerleri, kovalent olarak kendilerine bağlanan floresan molekül için sönümleyici olarak hareket etmektedir. Dolayısıyla, enzim kesimi sonrası serbest kalan floresan moleküllerinin sinyallerinde artış meydana gelmektedir. Floresans ışımadaki bu artış, enzim etkinliğinin ölçülmesinde kullanılmaktadır. Yapay DNA moleküllerinin moleküler uygulamalarından bir diğeri, DNA aptamerlerinin kullanımına dayalı çalışmalardır. DNA aptamerleri, özellikle son yıllarda, artan bir ilgiyle karşılanmaktadır. Bu moleküller, DNA oligomerlerinin özel bir grubunu oluşturmaktadır. DNA aptameleri, yapay, kısa DNA molekülleri olmakla beraber, belirli bir hedefe özgüdür. Bugüne kadar basit yapılı küçük moleküllerden, daha karmaşık protein moleküllerine kadar; bakteri gibi düşük yapılı organizmalardan yüksek yapılı ökaryotik hücrelere kadar çok geniş bir yelpazedeki hedeflere özgü DNA aptameri seçilmiştir. DNA aptamerlerinin, belirli bir hedefe özgü olarak seçilmesinde, bazı araştırmacılar tarafından tanımlanan ve canlı-dışı ayıklama adı verilen bir yöntem kullanılmaktadır. Buna göre, belirli bir hedefe özgü seçilmek üzere tasarlanan aptamer kütüphaneleri hedefle biraraya getirilmekte; çeşitli yıkama adımlarından sonra hedefe bağlananlar geri kazanılmakta ve bu DNA molekülleri, bir sonraki adımda yine bu sayılan bağlanma-yıkama-geri kazanım aşamalarından geçirilmektedir. Bu adımların birkaç kez tekrarlanmasının ardından, hedefe özgü olan DNA molekülleri yani DNA aptamerleri belirlenebilmektedir. Elde edilen bu DNA aptamerleri, ilgili hedefin tanısında algılayıcı molekül olarak iş görmektedir. Antikorlara seçenek olarak ortaya çıkan DNA aptamerleri, antikorlara kıyasla pekçok kazanıma sahiptir. Örneğin DNA aptamerleri, antikorlara göre daha kararlı moleküllerdir. Ayrıca, üretilmeleri için canlıya gereksinim duyulmaması nedeniyle hem ucuza hem de hızlı bir şekilde üretilebilmektedir. Kimyasal yollarla çok kolay bir şekilde değiştirilebilmeleri de bir başka kazanım olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu sayede, aptamerlere, floresan moleküller, sönümleyen moleküller, SH-grupları ve biyotin grupları takılabilmektedir. Kovalent bağ ile eklenebilen bu yan gruplar, belirli bir hedefe özgü seçilen DNA aptamerlerinin algılayıcı molekül olarak kullanıldığı biyo-algılayıcılarda, sinyal üretici olarak kullanılabilmektedir. Öyleki bu moleküllerin kullanıldığı, floresans temelli, elektrokimyasal temelli, elektriksel temelli, renk ölçümü temelli, enzim temelli, magnetik nanoparçacık temelli pekçok DNA aptameri uygulaması mevcuttur. Bugüne kadar, bakterilere özgü tanı amaçlı pek çok DNA aptamer molekülü seçilip yayımlanmıştır. Bulaşıcı bir hastalık olan veremle savaşımda, hızlı tanı konulmasına duyulan gereksinim nedeniyle geliştirilen pekçok teknik ve yöntemlere bir seçenek olarak DNA aptamerlerinin kullanımlarına ilişkin birçok çalışma yayımlanmıştır. Seçilen aptamerler, veremin tanısında kullanılmak üzere, vereme yola açan Mycobacterium tuberculosis bakterisinin çeşitli proteinlerine, hastalık sırasında bağışıklık sisteminden salınan bazı moleküllere veya tüm bakteriye özgü gerçekleştirilmiştir. Seçilen bazı aptamerlerin, hastalığın tedavisinde bir ümit olabileceği de gösterilmiştir. Dolayısıyla, benzer amaçlarla, yeni aptamerlerin seçimi önemlidir ve araştırmacıların ilgisini çekmeye devam etmektedir. Bu tez çalışması kapsmında, Mycobacterium tuberculosis H37Ra bakterisine özgü DNA aptamerleri seçilmiş, bakterilere bağlanma özgünlükleri gerçek zamanlı polimeraz zincirleme tepkimesi kullanılarak belirlenmiştir. Buna göre, Mtb36 olarak adlandırılan DNA aptamerlerinin, hedef bakteri olan Mycobacterium tuberculosis bakterisine, yakın akrabalık ilişkisinde olduğu Mycobacterium bovis bakterisine göre 3,8 kat; uzak akrabalık ilişkisinde olduğu Escherichia coli bakterisine göre ise 68 kat daha fazla bağlandığı hesaplanmıştır. Sonuç olarak, tez çalışması kapsamında Salmonella ser. Typhimurium, Escherichia coli ve Staphylococcus aureus bakterilerinin genomik DNA’larının saflaştırılmasında kullanılacak ucuz, kolay, hızlı ve yüksek verimlilikli, yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Kovalent bağlı floresan molekülü taşıyan DNA oligomerlerinin kullanımına dayalı, DNA nükleaz enzim etkinliğinin ölçümünde kullanılabilecek, ucuz, hızlı ve duyarlı yeni bir yöntem geliştirilmiş, bunlar için hem ulusal hem de uluslararası buluş hakkı (patent) başvurusu yapılmıştır. Veremin klinik tanısında kullanılmak üzere Mycobacterium tuberculosis H37Ra bakterisine özgü DNA aptamerleri seçilmiş ve bu aptamer moleküllerinin dizileri için hem ulusal hem de uluslararası buluş hakkı başvurusu yapılmıştır.
In this study, it was presented three different applications of DNA based molecular approaches: the use of DNA molecules as genetic material for diagnosis; the use of DNA oligomers for diagnosis; the use of DNA aptamers for diagnosis. DNA molecules are genetic materials and are used for many purposes in molecular biology, genetics, and biotechnology. First one is the use of DNA molecules for diagnosis. DNA molecules are used as a target for determination of phylogenetic relationships, for detection of the microorganisms which have pathogenicity, for diagnosis of genes that causes diseases, for determination of genetically modified organisms, and for criminal researches. For the purposes, the polymerase chain reaction (PCR) technique are usually used. The polymerase chain reaction (PCR) technique is based on amplification of DNA molecules by repetitive cycles under special conditions. It is needed to provide the most proper conditions as both chemically and physically for DNA polymerase enzyme which is used in this technique. DNA molecules which are substrates of DNA polymerase enzymes are purified from living organisms using different techniques or methods and subjected to the polymerase chain reaction. After then, DNA molecules which are added to the reaction effects the results of PCR directly. Impruities which comes from lysate during extraction and purification steps, or low of copy number of the DNA molecules obtained, or low quality of the DNA molecules may lead to a bad result. No amplification, non-specific amplification, or low amplification are some of these negativity. Under optimal conditions, number of the DNA are doubled in every PCR cycle, therotically. However, this situation can change because of chemical and physical conditions of polymerase chain reaction. So, some special techniques and methods are requested to obtain DNAs which are in high yield and in high quality from living organisms. For this purpose, today, there are several conventional methods and commercial products which are usually based in these conventional methods. Some of these conventional methods are boiling method, freeze and thown method, and guanidinium isothiocyanate based method. DNA molecules may be broken in the use of the boiling method and the freeze-thown method especially. Moreover, inpurities can be high because of lack of purification steps. Guanidinium isothiocyanate based methods can be performed by using some chemicals which can be found in many molecular biology laboratories easily. However, they may need to use some harmful chemicals such as phenol, chloroform for purification. Besides all these, commercial products which were developed for DNA extraction and purification provides high purity DNA and high yields of DNA. Despite these good results, these commercial products are more expensive than conventional methods and so, they can not be used by each laboratory. For the purpose, new methods which use some chemicals found in many laboratories, do not need using of the harmful chemicals are requested. Furthermore, these methods should be rapid and provide high purity DNA and high yields of DNA comparable to commercial products. For the purpose, in this thesis study, a new method based on guanidinium isothiocyanate for genomic DNA purification was developed. Using this method, genomic DNAs were obtained from Salmonella ser. Typhimurium, Escherichia coli ve Staphylococcus aureus. Two commercial genomic DNA extraction and purification kits and two conventional DNA extraction methods such as the boiling method, the freze-thaw method were used for comparison. It was determined that the new genomic DNA extraction and purification method provides high yields of DNA comparable to commercial products and more higher yields of DNA than conventional methods used for comparison. Another application for DNA based molecular approaches is the use of synthetic DNA molecules. These synthetic DNA molecules are usually short DNA molecules and they are called as DNA oligomers. These molecules are commonly used in nanobiotechnology and molecular biology. Small devices called as microarray offer a huge contribution for diagnose of many diseases for researchers by using DNA oligomers attached on microarray surfaces. Furthermore, polymerase chain reaction can perform by using these DNA oligomers. These molecules have complementary sequences at some sequences of template DNA and they are called as primer. Since polymerase chain reaction which is commonly used to diagnose have to use the DNA oligomers or primers, DNA oligomers are very important in molecular diagnosis and commonly used. Moreover, chemically modified DNA oligomers are used for real time polymerase chain reaction (Real-Time PCR) which is an improved application of polymerase chain reaction and these chemically modified DNA oligomers are called as probes. Probes are DNA oligomers which are attached to fluorescent or quencher molecules and they help to monitor DNA amplification during polymerase chain reaction. So, polymerase chain reaction can also be used for quantitative purposes besides qualitative purposes. These features can be used for drug development and diagnosis of drug resistence genes. Moreover, DNA oligomers which are attached to fluorescent or quencher molecules chemically can be used for determination of deoxyribonuclease (DNAse) activities as a substrate. DNA oligomers can form special three dimensional structure if they are designed specifically. So, quencher and fluorescent moleceules attached to DNA oligomers may become close to each other. At this position, fluorescence signal is quenched. After cutting by deoxyribonucleases, these quencher and fluorescence molecules are separated from each other, and then fluorescence signal inreases. These increases in the fluorescence signal can be used for monitoring of nuclease enzyme activities. In addition to this model which was published before, some researchers suggested a new model which uses DNA oligomers attached to only one fluorescent molecule covalently and cationic polymers to amplify fluorscence signal. Unlike two these models, in this thesis study, we suggested a new, rapid, and sensitive model for detection of deoxyribonuclease activities. According to our model, it does not need any cationic polymers, or any quencher molecules. In this new method, DNA oligomers act as quencher molecules for fluorescent molecules that are attached to the end of DNA oligomers. After cutting, fluorescent molecules become free, and fluorescence signal increases. These increases are be used for detection of DNA nuclease activites. Another DNA based molecular application is about the use of DNA aptamers. There are a number of studies about DNA aptamers in recent years. These molecules are a group of DNA oligomers. In addition to being short and synthetic, they are also specific for a certain target. DNA aptamers have been selected for a number of targets such as small molecules, proteins, bacteria, and eukaryotic cells. The selection of DNA aptamer have been performed using in-vitro selection process which was published by some researchers. According to this, after designing of the aptamer libraries, the library is mixed with together targets, after washing , DNA molecules are eluted to separate bound ones from unbound ones. These steps are repeated several times. After repeats, DNA aptamers are determined. DNA aptamers obtained are used as a sensor molecule to detect targets. DNA aptamers which are alternatives to antibodies have more advantages than antibodies. For example, DNA aptamers are more stable than antibodies. In addition to they can be produced easily and cheaply due to lack of a need living organisms to product. They can easily be modified chemically. For example, fluorescent molecules, quencher molecules, SH-groups, and biotin groups can be attached to. These chemical groups can be used as signal producers in biosensors. Fluorescence based methods, electrochemical based methods, electricity based methods, colormatic based methods, enzyme based methods, magnetic nanoparticle based methods have been published until today. Several DNA aptamer molecules against bacteria have been selected and published until now. There are several studies published about DNA aptamers against detection of tuberculosis, because tuberculosis is contagious disease and it is requested new techniques and methods to diagnose it. Aptamers which were about diagnosis of tuberculosis use as a target for proteins of Mycobacterium tuberculosis, immunological components, and whole bacteria. Some of these selected aptamers were also shown that they can be used for treatment. So, for the same purposes, selection of new aptamer molecules are important and attractive for researches. In this thesis study, new DNA aptamers against Mycobacterium tuberculosis H37Ra were selected. Their specificities were shown using real time polymerase chain reaction. According to this, aptamer Mtb36 was bound at least 3,5 and 68 times higher times more to Mycobacterium tuberculosis H37Ra than Mycobacterium bovis, and Escherichia coli which is a phylogenetically more distant species, respectively. As a result, in this thesis study, a cheap, easy, quick, in high yield new method to extract and purify DNA molecules from Salmonella ser. Typhimurium, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus, bacteria was developed. A cheap, quick, and sensitive new method based on DNA oligomers attached to fluorescent molecules were developed to monitor DNA nuclease activities. For this new method, both national and international patent applications were filed. DNA aptamers against Mycobacterium tuberculosis H37Ra bacteria were selected to use for detection of tuberculosis in clinical practice. For these new DNA aptamer sequences, both national and international patent application were also filed.
Description: Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013
Thesis (PhD) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2013
URI: http://hdl.handle.net/11527/3661
Appears in Collections:Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Lisansüstü Programı - Doktora

Files in This Item:
There are no files associated with this item.


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.