Biyonanoteknoloji İçin Çift İşlevli Proteinin Genetik Tasarımı Ve Sentezi

Abstract

GEPI diye adlandırılan genetik olarak üretilmiş peptidler tek başlarına kullanılabileceği gibi fonsiyonel proteinlerin füzyon kısmı olarak da kullanılabilinir. Bu sebeple, GEPI’yi rekombinant DNA teknolojisi ile üretmek ve farklı proreinlerle birleştirildiğinde anorganik bağlama işlevinin kontrolünü yapmak için gerekli olan yöntemler çok önemlidir. Bu çalışmada, GEPI’nin maltoz bağlayan proteinde (MBP) füzyon kısım olarak davranacağı bir rekombinant üretim yöntemi geliştirmeyi amaçladık. Bu çalışmadaki iki ana hedef, ileri sürülen yöntemin uygulanabilirliğini göstermek için MBP-GEPI çift işlevli proteinin genetik mühendisliği ve saflaştırlmasıdır. Bunu göstermek için füzyon kısım olarak kullanacağımız altına bağlanan peptid diye adlandırılan AuBP1 ve silikaya bağlanan peptid olarak bilinen QBP2 peptidleri seçildi. Aynı zamanda füzyon yapılarin çift işlevli aktivitelerinde herhangi bir peptid bağlayıcının etkinliğini kontrol etmek için MBP ve GEPI arasına S(G)3 ve (PG)3 gibi iki farklı peptid bağlayıcı yerleştirildi. Proteinlerin üretilmesinde ise pMAL ekspresyon ve saflaştırma sisteminden yaralanıldı. pMALc2X vektörleri oluşturulup Luria Bertani besiyerinde ilgili proteinler üretilerek amiloz ilgi kromatografisi ile saflaştırıldı. Çift işlevli proteinlerin saflaştırılması optimize edildikten sonra proteinlerin moleküler ağırlıkları kütle spektrometresiyle doğrulandı. Bu yapıların, protein-metal ve protein-metal oksit biyoduyarga ve biyoanalizlerin oluşumunda yeni alternatiflere öncü olacaklarına inanılmaktadır. Dahası genetik olarak tasarlanmış çift işlevli proteinler biyomedikal alanda ve nanoelektronikte, altına ve kuvartza bağlanma özelliklerinden dolayı farklı malzemelerin yapımında da kullanılabileceklerdir.

Genetically engineered peptides for inorganics called GEPI can be used alone or as a fusion partner in functional proteins. Therefore, the methods to produce them via recombinant DNA technology and to check their inorganic binding functionality once they are inserted into different protein domains, are crucial. We aim to develop a recombinant production method for GEPI as a fusion partner in maltose binding protein (MBP). Two main objectives of this study are genetic engineering and purification of MBP-GEPI bi-functional protein in order to demonstrate applicability of the proposed method. To demonstrate this, we selected two GEPIs to produce as fusion partners, namely gold binding peptide (AuBP1) and quartz binding peptide (QBP2). We also used two different peptide linkers as S(G)3 and (PG)3 between MBP and GEPI in the expression to test the effect of linkers in bi-functional activities of the fusion constructs. For the expression of the proteins, pMAL expression and purification system was used. The vectors, pMALc2X, were constructed, and bi-functional proteins were expressed in Luria Bertani medium and purified by amylose affinity chromatography. Purification of the bi-functional protein has been then optimized and the mass of resulting protein has been confirmed by mass spectrometry. We believe these constructs will lead to new facile alternatives in the formation of protein-metal and protein-metal oxide biosensors and bioassays. Moreover, the genetically designed bi-functional proteins can be used to create different material architectures in biomedical fields and nano-electronics due to gold and quartz binding peptide features.