Badem İlave Edilen Çikolatalarda Antioksidan Kapasite Değişimlerinin İncelenmesi

Abstract

Kakao ve kakao ürünlerine ait çalışmalar, bu ürünlerin sağlığı geliştirici özelliklerinden dolayı ilgi çekmektedir. Son yıllarda yapılan epidemiyolojik çalışmalar kakao ve kakao tozu, kakao likörü ve bitter çikolata gibi kakao ürünlerinin tüketilmesinin kanseri, kalp ve damar hastalıklarını önlemede önemli rolünün olduğunu göstermektedir. Kakaonun sağlığı geliştirici özellikleri fenolik bileşiklerine, temel olarak flavonoidlere dayandırılmaktadır. Kakaoda bulunan flavonoidleri daha çok proantosiyanidinler, flavonoller ve antosiyaninler oluşturmaktadır. Kakaonun yüksek flavonoid içeriği monomerik formdaki (-)-epikateşin, (+)-kateşin ve polimerik formdaki prosiyanidinleri içeren flavan-3-oller veya flavonoller ile tanımlanmaktadır. Buna karşılık, bademin fenolik içeriği ve antioksidan kapasitesi kakao türevlerine göre daha düşüktür. Ayrıca badem fenoliklerinin büyük bir kısmı bademin kabuğunda depolanmıştır. Bunun yanında, badem diğer kuruyemişlerle karşılaştırıldığında yüksek protein ve &#945;-tokoferol içeriğiyle farklılık göstermektedir. Çikolata ve şekerleme endüstrilerinde badem sıkça kullanılmaktadır. Kakao ve kakao ürünlerinin besin değeri prosesin antioksidan kapasite gösteren değerli bileşiklerin üzerine etkisi konusunda ilgi çekmektedir. Kakao türevi ürünlerinin fenolik içeriği kakaonun cinsine, çeşidine, kökenine, tarımsal ve hasat sonrası uygulamalara ve prosese büyük ölçüde bağlıdır. Bu nedenle, kakao çekirdeğinden çikolataya kadar bütün üretim basamaklarının toplam fenolik ve flavonoid içerik ile antioksidan kapasite üzerine etkisinin anlaşılması çok önemlidir. Bu çalışmada, bitter çikolata üç farklı formülasyon olarak; %65 kakao ve %15 badem içeriği (formülasyon A), %65 kakao ve %7,5 badem içeriği (formülasyon B), %65 kakao içeriği (kontrol, formülasyon C) pilot ölçekli laboratuar ortamında üretilmiştir. Formülasyon A ve B kabuğu soyulmuş badem içermektedir. Genel olarak çikolata üretimi, karıştırma, inceltme, konçlama, temperleme, kalıplama ve kalıptan dökme aşamalarından oluşmaktadır. Bu çalışmada, üç farklı bitter çikolata numunesinin toplam fenolik içerikleri, toplam flavonoid içerikleri ve ABTS, DPPH, CUPRAC ve FRAP gibi farklı spektrofotometrik metodlar kullanılarak toplam antioksidan kapasiteleri çikolata üretiminin her aşamasında karşılaştırılmıştır. Spektrofotometrik analizlerin öncesinde, %70 metanol ve %80 metanol kullanılarak en iyi ekstraksiyon çözgeninin bulunabilmesi için toplam fenolik miktarı, toplam flavonoid miktarı ve ABTS, DPPH, CUPRAC ve FRAP metodları kullanılarak antioksidan kapasitesi kakao çekirdeklerinde analizlenmiştir. Kakao çekirdekleri için %80 metanol ekstraktındaki toplam fenolik içerikleri %70 metanol ekstraktlarına oranla %34 daha fazladır. Bunun yanında, kakao çekirdeklerinin flavonoid içeriği %80 metanol ekstraklarında %70 metanol ekstraklarına göre %30 daha fazladır. Kakao çekirdeği numunelerinin ABTS ve DPPH sonuçları %80 metanol ekstraklarının %70 metanol ekstraklarına göre sırasıyla %9 ve %39 daha yüksek değerler verdiğini göstermektedir. Benzer olarak, CUPRAC ve FRAP sonuçları da %80 metanol ekstraklarının %70 metanol ekstraklarına göre sırasıyla %11 ve %30 daha yüksek değerler verdiğini göstermektedir. Sonuç olarak, spektrofotometrik analizler için ekstraksiyon çözgeni olarak %80 metanol seçilmiştir. Sonuçlar karıştırma aşamasında en yüksek toplam fenolik içeriğin formülasyon C’den (726,95 mg CE/100 g kuru madde (KM)) elde edildiğini ve bunu formülasyon B (704,22 mg CE/100 g KM) ve formülasyon A’nın (485,84 mg CE/100 g KM) takip ettiğini belirtmektedir. Aynı şekilde, en yüksek toplam flavonoid içeriğin de formülasyon C’den (573,81 mg CE/100 g KM) elde edildiğini ve bunu formülasyon B (519,42 mg CE/100 g KM) ve formülasyon A’nın (437,85 mg CE/100 g KM) izlediği belirtilmiştir. Sonuçlara göre, her bir formülasyon için en yüksek toplam antioksidan aktivite değerleri CUPRAC metoduyla elde edilmiştir. Formülasyon C 9836,63 µmol TEAC/100 g KM ortalama toplam antioksidan aktivitesine sahipken, formülasyon B ve A sırasıyla 7852,28 µmol TEAC/100 g KM ve 6798,04 µmol TEAC/100 g KM aktiviteye sahiptir. ABTS metodunun sonuçları formülasyon C’nin 6637,10 µmol TEAC/100 g KM ile en yüksek ortalama toplam antioksidan değerine sahip olduğunu ve bu değeri 5774,70 µmol TEAC/100 g KM (formülasyon B) ve 5275,22 µmol TEAC/100 g KM (formülasyon A) takip ettiğini göstermektedir. En düşük antioksidan aktivite değerleri DPPH metodu ile bulunmuştur. En yüksek değer 4493,97 µmol TEAC/100 g KM ile formülasyon C için bulunmuş ve bunu formülasyon B (4153,78 µmol TEAC/100 g KM) ve formülasyon A (3283,67 µmol TEAC/100 g KM ) değerleri izlemiştir. Diğer taraftan, FRAP metodu da ABTS ve CUPRAC metodlarıyla karşılaştırıldığında (formülasyon A için 3614,12 µmol TEAC/100 g KM, formülasyon B için 4361,84 µmol TEAC/100 g KM ve formülasyon C için 4834,42 µmol TEAC/100 g KM) düşük antioksidan aktivite değerleri vermektedir. ANOVA varyans analizi testine göre, karıştırma aşamasında çikolata formülasyonları arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemli (P<0,05) sonuç vermektedir. Toplam fenolik içerik, toplam flavonoid içerik ve antioksidan aktivite değerleri azalan sırayla formülasyon C,B ve A’da bulunmuştur. Çikolata üretiminin inceltme aşamasında, partikül boyutunun küçülmesine bağlı olarak toplam fenolik içeriğin, toplam flavonoid içeriğin ve toplam antioksidan kapasitenin karıştırma aşamasıyla karşılaştırıldığında önemli ölçüde yükseldiği bulunmuştur. Sonuçlar toplam fenolik içeriği formülasyon C’de (801,56 mg CE/100 g KM) en yüksek değeri verdiğini ve bunu formülasyon B (705,43 mg CE/100 g KM) ve formülasyon A’nın (622,48 mg CE/100 g KM) takip ettiğini göstermektedir. Benzer şekilde, en yüksek flavonoid içerik formülasyon C’de (759,65 mg CE/100 g KM) bulunmakta ve bunu formülasyon B (594,26 mg CE/100 g KM) ve formülasyon A (560,35 mg CE/100 g KM) takip etmektedir. Sonuçlara göre, her formülasyonda CUPRAC metodu en yüksek antioksidan aktivite değerlerini vermektedir. Formülasyon C 10395,96 µmol TEAC/100 g KM ortalama antioksidan aktivite değerine sahipken formülasyon B ve A sırasıyla 9514,55 µmol TEAC/100 g ve 8694,41 µmol TEAC/100 g değerlerine sahiptir. ABTS metodunun sonuçları da formülasyon C’nin en yüksek ortalama antioksidan aktivitesi (7817,07 µmol TEAC/100 g ) değerini verdiğini, bunu formülasyon B (7504,43 µmol TEAC / 100 g) ve formülasyon A’nın (6275,29 µmol TEAC/100 g) izlediğini göstermektedir. En düşük antioksidan aktivitesi değerleri DPPH metoduyla elde edilmiştir. En yüksek değer 4931,29 µmol TEAC/100 g KM ile formülasyon C için bulunmuş ve bunu formülasyon B (4197,56 µmol TEAC/100 g KM) ve formülasyon A (3765,78 µmol TEAC/100 g KM) izlemiştir. Bunun yanında, FRAP metodu da ABTS ve CUPRAC metodları ile karşılaştırıldığında daha düşük aktivite değerleri vermiştir (Formülasyon A için 4458,71 µmol TEAC/100 g KM, formülasyon B için 4597,15 µmol TEAC/100 g KM, formülasyon C için 5077,56 µmol TEAC/100 g KM). ANOVA varyans analizi testine göre, inceltme aşamasında çikolata formülasyonları arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemli (P<0,05) sonuç vermektedir. Karıştırma prosesine benzer şekilde, toplam fenolik içerik, toplam flavonoid içerik ve antioksidan kapasite en yüksekten düşüğe sırasıyla formülasyon C, B ve A’da gözlenmiştir. Konçlama aşamasında, çikolatanın fenolik ve flavonoid içeriği ve antioksidan kapasitesi sıcaklık uygulamasına bağlı olarak (70°C) düşme eğilimindedir. İnceltme aşamasında partikül boyutunun düşmesi in vitro antioksidan kapasiteyi arttırmasına rağmen, ısıl stabiliteyi düşürmektedir. Antioksidan kapasitenin devam eden konçlama ve temperleme aşamalarında düşmesi bazı antioksidan bileşiklerin ısıl stabilitesinin azalması sonucunda degradasyonu ile sonuçlanabilmektedir. Sonuçlar en yüksek toplam fenolik içeriğin formülasyon C’de (750,78 mg CE/100 g KM) elde edildiğini ve bunu formülasyon B (617,42 mg CE/100 g KM) ve formulasyon A’nın (532,61 mg CE/100 g KM) takip ettiğini göstermektedir. Benzer şekilde, formülasyon C en yüksek toplam flavonoid içeriğine (567,28 mg CE/100 g KM) sahiptir ve formülasyon A ve B kontrol örneği ile karşılaştırıldığında sırasıyla %30 ve %14 daha düşük sonuçlar vermektedir. Sonuçlara göre CUPRAC metoduyla her formülasyon için en yüksek toplam antioksidan aktivite sonuçlarına ulaşılmaktadır. Formülasyon C 10022,03 µmol TEAC/100 g KM ortalama toplam antioksidan aktivite değerine sahipken formülasyon B ve A sırasıyla 8612,71 µmol TEAC / 100 g KM ve 6741,48 µmol TEAC/100 g KM aktiviteye sahiptir. ABTS metoduna göre formülasyon C en yüksek toplam antioksidan değerine (6016,77 µmol TEAC/100 g KM) sahipken formülasyon A ve B’nin antioksidan kapasiteleri sırasıyla kontrol örneğiyle karşılaştırıldığında %24 ve %11 daha düşük değerler vermektedir. DPPH metodu en düşük antioksidan aktiviteyi veren metot olarak en yüksek değeri formülasyon C için (4331,42 µmol TEAC/100 g KM) vermekte ve bunu formülasyon B (3675,19 µmol TEAC/100 g KM) ve formülasyon A (2801,56 µmol TEAC/100 g KM) izlemektedir. Diğer yandan, FRAP metodu da ABTS ve CUPRAC metodları ile karşılaştırıldığında daha düşük aktivite sonuçları vermektedir. DPPH ve CUPRAC metodlarına benzer şekilde, formülasyon A ve B’nin antioksidan kapasiteleri kontrol örneğine göre (4929,54 µmol TEAC/100 g KM) sırasıyla yaklaşık %32 ve %16 daha düşüktür. ANOVA varyans analizi testine göre, konçlama prosesinde çikolata formülasyonları arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemlidir (P<0,05) ve fenolik bileşikler azalan sırasıyla formülasyon C,B ve A’da bulunmuştur. Temperleme aşamasında, toplam fenolik ve flavonoid içeriğinde ve antioksidan kapasitesinde konçlama aşamasıyla karşılaştırıldığında ürünün sürekli ısıtılması (46°) ve soğutulmasına (32°C) bağlı olarak önemli bir düşüş olmakta, fakat çikolata formülasyonlarının eğilimi değişmemektedir. Formülasyon A ve B’nin toplam fenolik içeriklerinin kontrol örneğine göre (610,31 mg CE/100 g KM) sırasıyla yaklaşık %31 ve %11 daha düşük olduğu bulunmuştur. Benzer şekilde, sonuçlar en yüksek toplam flavonoid içeriğinin formülasyon C’de (425,91 mg CE/100 g KM) bulunduğunu ve bunu formülasyon B (402,60 mg CE/100 g KM) ve formülasyon A’nın (338,84 mg CE/100 g KM) izlediğini belirtmektedir. En yüksek toplam antioksidan kapasite değerleri CUPRAC metoduyla bulunmuştur (Formülasyon C için 6741,48 µmol TEAC/100 g KM, formülasyon B ve A için de azalan sırayla 6573,36 µmol TEAC/100 g KM ve 5428,00 µmol TEAC/100 g KM). ABTS metodu sonuçları da formülasyon A ve B için kontrol örneği ile karşılaştırıldığında (5244,07 µmol TEAC/100 g KM) sırasıyla yaklaşık %26 ve %12 daha düşük değerler vermektedir. En düşük antioksidan aktivite değerleri DPPH metodunda elde edilmiştir ve bu metodla en yüksek değeri 3686,26 µmol TEAC/100 g KM ile formülasyon C vermiştir. Bunu formülasyon B (3322,42 µmol TEAC/100 g KM) ve formülasyon A (2506,66 µmol TEAC/100 g KM) izlemektedir. Bunun yanında, FRAP metodu da ayrıca ABTS ve CUPRAC metodlarına göre daha düşük aktivite değerleri ile vermektedir. ABTS ve DPPH metodlarına benzer olarak, formülasyon A ve formülasyon B temperleme prosesinde kontrol örneği (4037,50 µmol TEAC/100 g KM) ile karşılaştırıldığında sırasıyla yaklaşık %27 ve %14 daha düşük sonuçlar vermiştir. ANOVA varyans analizi testine göre, çikolata formülasyonları arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemlidir (P<0,05). En yüksek toplam fenolik içerik, toplam flavonoid içerik ve antioksidan kapasite değerleri sırasıyla C,B ve A formülasyonlarında elde edilmiştir. Çikolata son ürünlerdeki veriler, karşılaştırılabilirlik açısından aynı metod kullanılarak yağın örneklerden uzaklaştırılmasında yaşanan zorluklardan dolayı çok açıklayıcı değildir. Sadece CUPRAC metodunun sonuçları temperleme prosesi ile aynı eğilimi göstermektedir. Sonuçlara göre, en yüksek antioksidan aktivite değerleri her formülasyon için yine CUPRAC metoduyla elde edilmiştir. Formülasyon A 6540,72 µmol TEAC/100 g KM ortalama toplam antioksidan aktiviteye sahipken, formülasyon B ve C sırasıyla 7076,72 µmol TEAC/100 g KM ve 6668,15 µmol TEAC/100 g KM aktivitelerine sahiptir. Bu çalışmada ayrıca çikolata üretiminde kullanılan temel malzemelerin toplam fenolik ve flavonoid içerikleri ve antioksidan kapasiteleri, tekrarlanan iki üretimdeki her formülasyonda kullanılan malzemelerden kaynaklanan bir farklılık olup olmadığını değerlendirebilmek için ölçülmüştür. Birinci ve ikinci üretimde kullanılan farklı malzemelerin toplam fenolik içerik, toplam flavonoid içerik ve toplam antioksidan aktivite üzerine etkisinin değerlendirilebilmesi için birinci ve ikinci üretimde kullanılan hammaddeler arasında T testi analizi gerçekleştirilmiştir. T testi analizi sonucunda birinci ve ikinci üretimde kullanılan hammaddeler arasında istatistiksel olarak önemli farklılık bulunmuştur (P<0,05). Duyusal analiz bölümünde, çikolata numunelerinin duyusal özelliklerini karşılaştırabilmek için Kantitatif Tanımlama Analizi tekniği kullanılmıştır. İstanbul Teknik Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü’nden oniki eğitimli panelist duyusal panele katılmıştır. Panelistler algılanan duyusal özellikleri teşhis etmiş ve tanımlamış, sonrasında da her duyusal özellik için terminoloji üzerine fikir birliği oluşturulmuştur. Daha sonra, panelistler her özelliğin yoğunluğunu referans çikolata örnekleri kullanılarak 0-7 kategori skalasında değerlendirmeleri için 6 saat boyunca çalışmıştır. Panel çikolata örnekleri için toplam 20 farklı tanımlayıcı terim üzerinde anlaşmıştır. Kruskal-Wallis nonparametrik testi, panelistler tarafından önceden belirlenmiş tanımlayıcı özellikler için farklı çikolata örnekleri arasında anlamlı bir farklılık olup olmadığının belirlenmesi amacıyla iki duyusal panelin de verilerini analiz etmek için kullanılmıştır. Bu çalışmanın sonucunda üç çikolata formülasyonu arasında badem içeriğine bağlı olarak, badem kokusu (H(2) = 24,331, p = 0,000), badem aroması (H(2) = 14,851, p = 0,001), bitter tat (H(2) = 6,077, p = 0,048), yağlılık H(2) = 18,213, p = 0,000), erime hızı (H(2) = 7,267, p = 0,026), sertlik (H(2) = 8,514, p = 0,014) ve ağızda yağlılık hissi (H(2) = 13,455, p = 0,001) özelliklerinde istatistiksel olarak önemli farklılıklar (P<0,05) olduğu belirtilmiştir.

The studies of cocoa and cocoa derived products have become an area of interest according to their health-promoting properties. Many epidemiological studies in recent years suggest that consumption of cocoa and cocoa derived products such as cocoa powder, cocoa liquor and dark chocolate can play an important role in preventing cancer and cardiovascular diseases. The health-promoting properties of cocoa were attributed to their phenolic compounds, mainly flavonoids. Flavonoids present in cocoa include mainly proanthocyanidins, flavonols and anthocyanins. High flavonoid content of cocoa is characterized with flavan-3-ols or flavonols including monomeric forms, (-)-epicatechin, (+)-catechin and the polymeric forms (procyanidins). On the other hand, almond has a lower phenolic content and antioxidant capacity when compared to cocoa derivatives. Moreover, most of the almond phenolics are deposited in the skin of almonds. Besides, almonds are unusual according to their high protein and &#945;-tocopherol contents compared to other nuts. They are often used in the chocolate and confectionary industries. The nutritional value of cocoa and cocoa derivatives created a great interest in the effect of processing on their valuable compounds showing antioxidant capacity. The phenolic content of cocoa derived products is largely dependent upon the cocoa variety, cultivar, origin, agricultural and postharvest practices and processing. Therefore, understanding the effect of all the manufacturing processes from cocoa bean to chocolate on the total phenolic and flavonoid content and antioxidant capacity is crucial. In this study, dark chocolate was produced by using three different formulations; 65% cocoa and 15% almond content (formulation A), 65% cocoa and 7.5% almond content (formulation B) and 65% cocoa content (control, formulation C) in a pilot scale laboratory plant. Deskinned almond paste was used in formulation A and B. In general, chocolate manufacturing include the five basic steps of mixing, refining, conching, tempering, and moulding and demoulding. In this study, three different dark chocolate samples were compared for their total phenolic contents, total flavonoid contents and total antioxidant capacities using different spectrophotometric methods such as 2,2-azinobis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS), 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), ferric reducing antioxidant power (FRAP) and copper reducing antioxidant capacity (CUPRAC) in all steps of chocolate manufacturing. Prior to spectrophotometric analysis, the best extraction solvent out of 70% methanol and 80% methanol was investigated by analyzing the amount of total phenolics, total flavonoids and antioxidant capacities with ABTS, DPPH, CUPRAC and FRAP methods of cocoa beans. Total phenolic contents of cocoa beans in 80% methanol extracts were 34% higher than that of 70% methanol extracts. Besides, total flavonoid contents of cocoa beans in 80% methanol extracts were 30% higher than that of 70% methanol extracts. ABTS and DPPH results of cocoa bean samples showed that 80% methanol extracts yielded with 9% and 39% higher values than 70% methanol extracts, respectively. Similarly, CUPRAC and FRAP results showed that 80% methanol extracts were 11% and 30% higher compared to the 70% methanol extracts. As a result, 80% methanol was selected as the extraction solvent for spectrophotometric analysis. The results indicated that highest total phenolic content was obtained in formulation C (726.95 mg CE/100 g dry matter (DM)), followed by formulation B (704.22 mg CE/100 g DM) and formulation A (485.84 mg CE/100 g DM) in mixing process. Similarly, highest total flavonoid content was observed in formulation C (573.81 mg CE/100 g DM), followed by formulation B (519.07 mg CE/100 g DM) and formulation A (437.85 mg CE/100 g DM). According to the results, the highest total antioxidant activity values were measured by CUPRAC method for each formulation. Formulation C had an average total antioxidant activity of 9836.63 µmol TEAC/100 g DM, whereas formulation B and A had activity values of 7852.28 µmol TEAC/100 g DM and 6798.04 µmol TEAC/100 g DM, respectively. The results of the ABTS method showed that formulation C had the highest average total antioxidant value of 6637.10 µmol TEAC/100 g DM, followed by 5774.70 µmol TEAC/100 g DM (formulation B) and 5275.22 µmol TEAC/100 g DM (formulation A). The lowest antioxidant activity values were obtained by DPPH method which indicated 4493.97 µmol TEAC/100 g DM as the highest value for formulation C, followed by formulation B (4153.78 µmol TEAC/100 g DM) and formulation A (3283.67 µmol TEAC/100 g DM ). On the other hand, FRAP method also resulted in lower activity values in comparison with ABTS and CUPRAC methods (3614.12 µmol TEAC/100 g DM for Formulation A, 4361.84 µmol TEAC/100 g DM for Formulation B, and 4834,42 µmol TEAC/100 g DM for Formulation C). According to one way ANOVA variance analysis test, the differences among different chocolate formulations were statistically significant (P<0.05) in mixing process. The total phenolic content, total flavonoid content and antioxidant capacity values were observed in the order of formulation C, B and A. In refining step of the chocolate production, it was observed that the total phenolic content, total flavonoid content and the total antioxidant capacity significantly increased compared to the mixing step according to the reduction of particle size. The results indicated that highest total phenolic content was observed in formulation C (801.56 mg CE/100 g DM, followed by formulation B (705.43 mg CE/100 g DM) and formulation A (622.48 mg CE/100 g DM) in refining process. Similarly, highest total flavonoid content was observed in formulation C (759.65 mg CE/100 g DM), followed by formulation B (594.26 mg CE/100 g DM) and formulation A (560.35 mg CE/100 g DM). According to the results, the highest total antioxidant activity values were measured by CUPRAC method for each formulation. Formulation C had an average total antioxidant activity of 10395.96 µmol TEAC/100 g DM, whereas formulation B and A had activity values of 9514.55 µmol TEAC/100 g DM and 8694.41 µmol TEAC/100 g DM , respectively. The results of the ABTS method showed that formulation C had the highest average total antioxidant value of 7817.07 µmol TEAC/100 g DM , followed by 7504.43 µmol TEAC/100 g DM (formulation B) and 6275.29 µmol TEAC/100 g DM (formulation A). The lowest antioxidant activity values were observed by DPPH method which indicated 4931.29 µmol TEAC/100 g DM as the highest value for formulation C, followed by formulation B (4197.56 µmol TEAC/100 g DM) and formulation A (3765.78 µmol TEAC/100 g DM). On the other hand, FRAP method also resulted in lower activity values in comparison with ABTS and CUPRAC methods (4458.71 µmol TEAC/100 g DM for formulation A, 4597.15 µmol TEAC/100 g DM for formulation B, and 5077.56 µmol TEAC/100 g DM for formulation C). According to one way ANOVA variance analysis test, the differences among different chocolate formulations were statistically significant (P<0.05) in refining process. Similar to the mixing process, the total phenolic content, total flavonoid content and antioxidant capacity values were obtained in the order of formulation C, B and A in refining process. In conching process, the trend of chocolate phenolic and flavonoid contents and total antioxidant capacity values were reduced based on heat treatment (70°C). Although particle size reduction increases in vitro antioxidant capacity in refining process, the thermal stability reduces. The decrease of the antioxidant capacity in the following conching and tempering steps might be resulted from degradation of some antioxidant compounds due to reduced thermal stability. The results indicated that highest total phenolic content was observed in formulation C (750.78 mg CE/100 g DM), followed by formulation B (617.42 mg CE/100 g DM) and formulation A (532.61 mg CE/100 g DM). Similarly, formulation C had highest total flavonoid content (567.28 mg CE/100 g DM) and formulation A and formulation B gave lower results of 30% and 14% compared to the control sample, respectively. According to the results, the highest total antioxidant activity values were obtained by CUPRAC method for each formulation. Formulation C had an average total antioxidant activity of 10022.03 µmol TEAC/100 g DM, whereas formulation B and A had an activity of 8612.71 µmol TEAC/100 g DM and 6741.48 µmol TEAC/100 g DM, respectively. The results of the ABTS method showed that formulation C had the highest average total antioxidant value of 6016.78 µmol TEAC/100 g DM and 24% and 11% lower antioxidant capacities were observed for formulation A and formulation B compared to the control sample, respectively. The lowest antioxidant activity values were obtained by DPPH method which indicated 4331.42 µmol TEAC/100 g DM as the highest value for formulation C, followed by formulation B (3675.19 µmol TEAC/100 g DM) and formulation A (2801.56 µmol TEAC/100 g DM). On the other hand, FRAP method also resulted with lower activity values in comparison with ABTS and CUPRAC methods. Similarly to the DPPH and CUPRAC methods, antioxidant capacities of formulation A and B were about 32% and 16% lower than the control sample (4929.54 µmol TEAC/100 g DM ), respectively. According to one way ANOVA variance analysis test, the differences among different chocolate formulations were statistically significant (P<0.05) in conching process and phenolic compounds were observed in the order of formulation C, B and A. In tempering process, there were significant reductions in the total phenolic and flavonoid contents and antioxidant capacities compared to conching step according to continuous heating (46°C) and cooling (32°C) of the chocolate products, but the trend of the chocolate formulations were the same. The total phenolic contents of formulation A and formulation B were found to be about 31% and 11% lower than the control sample (610.31 mg CE/100 g DM), respectively. Similarly, the results indicated that highest total flavonoid content was obtained in formulation C (425.91 mg CE/100 g DM), followed by formulation B (402.60 mg CE/100 g DM) and formulation A (338.84 mg CE/100 g DM). The highest total antioxidant capacity values were obtained by CUPRAC method for each formulation (6741.48 µmol TEAC/100 g DM for formulation C, 6573.36 µmol TEAC/100 g DM for formulation B and 5428.00 µmol TEAC/100 g DM for formulation A in descending order). The results of the ABTS method indicated that about 26% and 12% lower values for antioxidant capacities of formulation A and formulation B were obtained as a comparison with the control sample (5244.07 µmol TEAC/100 g DM ), respectively. The lowest antioxidant activity values were obtained by DPPH method which indicated 3686.26 µmol TEAC/100 g DM as the highest value for formulation C, followed by formulation B (3322.42 µmol TEAC/100 g DM ) and formulation A (2506.66µmol TEAC/100 g DM ). Besides, FRAP method also resulted with lower activity values in comparison with ABTS and CUPRAC methods. Similar to results obtained by ABTS and DPPH methods, in tempering process the antioxidant capacities of formulation A and formulation B were 27% and 14% lower than the control sample (4037.50 µmol TEAC/100 g DM), respectively. According to one way ANOVA variance analysis test, the differences among different chocolate formulations were statistically significant (P<0.05) in tempering process. The total phenolic content, total flavonoid content and antioxidant capacity values were obtained in the order of formulation C, B and A in tempering process. The data of the chocolate final products were not very clear due to the difficulties of lipid removal from the samples using the same method for comparison. Only the CUPRAC method indicated the same trend with the tempering process. According to the results, the highest total antioxidant activity values were obtained by CUPRAC method for each formulation. Formulation A had an average total antioxidant activity of 6540.72 µmol TEAC/100 g DM, whereas formulation B and C had activity values of 7076.72 µmol TEAC/100 g DM and 6668.15 µmol TEAC/100 g DM, respectively. In the study, the total phenolic and flavonoid contents and antioxidant capacities of the major ingredients used in each production were also measured to evaluate if there were any differences resulting from the ingredients used in each formulation between the two productions. Paired t-test analysis was performed between the first and the second production major ingredients to compare the effect of using different ingredients on total phenolic content, total flavonoid content and total antioxidant activity. The results of t-test indicated that the differences between the first and the second production were found to be statistically significant (P<0.05). In the sensory analysis section, The Quantitative Descriptive Sensory Analysis Technique was used to compare all the sensory characteristics of chocolate samples. Twelve trained panelists from Istanbul Technical University, Food Engineering Department participated to the sensory panels. Panelists identified and defined the perceived sensory characteristics, and furthermore they reached to consensus on terminology for each sensory property. Panelists were then trained to evaluate the intensity of each characteristic using reference chocolate products on a 0-7 point category scale for 6 h. The panel agreed upon a total of 20 different descriptive terms in chocolate samples. The Kruskal-Wallis nonparametric test was used to analyze the sensory analysis data of two sensory panels to determine whether there were significant differences (P<0.05) between different chocolate samples for predetermined descriptives tested by the panelists. The results of this study indicated that there were statistically significant differences between three formulations of chocolate for the characteristics of almond odor (H(2) = 24.331, p = 0.000), almond aroma (H(2) = 14.851, p = 0.001), bitter taste (H(2) = 6.077, p = 0.048), oily taste H(2) = 18.213, p = 0.000), melting rate (H(2) = 7.267, p = 0.026), firmness (H(2) = 8.514, p = 0.014), and oily mouthfeel (H(2) = 13.455, p = 0.001) depending on the almond content.