Ph’ya Duyarlı Antibiyotik Salımı Yapan Yara Örtüsü Geliştirilmesi

Abstract

Yara, deri bütünlüğünün ve fonksiyonlarının fiziksel ya da fizyolojik sebeplerle bozulmasıdır. Yaralar akut ve kronik olmak üzere ikiye ayrılabilir. Akut yaralar çoğunlukla mekanik yaralanmalar sonucu oluşmaktadır ve iyileşme süreci genellikle 8-12 hafta arasındadır. Kronik yaralar ise genellikle mikroorganizmalar tarafından kontamine edilmiş, doku kaybı içeren ve iyileşme süreci 12 haftayı geçen yaralardır ve bu tip yaralar genellikle tekrar ederler. Yara iyileşmesi kompleks bir süreç olup birçok aşama içermektedir. Bu süreci hızlandırmak için yara örtü malzemeleri kullanılmaktadır. Seçilecek yara örtü malzemesi; yaranın tipine ve patolojik durumuna bağlıdır. Farklı yara tipleri için ticari olarak satılan farklı yara örtü malzemeleri bulunmaktadır. Yara örtü malzemeleri, yara iyileşme sürecinde nemli ortam sağlamalı ve iyileşme süreci boyunca korumalıdır. Buna ek olarak, yaradan sızan fazla sıvıyı tutmalı, gaz alışverişine izin vermeli, toksik olmamalı, yaraya mekanik destek vermeli, mikroorganizma geçişine izin vermemeli ve örtü değişimi sırasında ağrıya sebep olmamalıdır. Tüm bu amaçlara ulaşabilmek için iki katlı yara örtü malzemeleri tasarlanmaktadır. Alt katman daha gözenekli yapıda oluşturularak yaradan sızan fazla sıvıyı tutup, yaraya yapışıp yarayı desteklemeyi amaçlamaktadır. Daha yoğun yapıdaki üst katman ise mikroorganizma girişine engel olacak şekilde tasarlanmaktadır. Avantajlarından dolayı bu çalışmada iki katlı yara örtüsü çalışılmıştır. Yara örtü malzemelerini daha fonksiyonel hale getirmek için aktif ajanlar eklenmektedir. Büyüme faktörleri, antimikrobiyal ajanlar ve diğer ilaçlar aktif ajanlara örnek olarak verilebilir. Yaralarda enfeksiyon olması durumunda yara iyileşmesi geciktiğinden antibiyotik içeren yara örtüleri kullanılması tercih edilmektedir. Antibiyotiklerin yara örtü malzemeleriyle lokal olarak verilmesi daha az miktarda ilaçla gerekli doza ulaşılmasını sağlamaktadır. Bu yolla sistemik yolla antibiyotik alımında yaşanan toksisitenin azalması yanında mikroorganizmalar tarafından direnç oluşması olasılığı da azaltılmaktadır. Gentamisin ve siprofloksasin hem gram negatif hem gram pozitif organizmalara karşı etkili geniş spektrumlu birer antibiyotiktir. Yara enfeksiyonlarındaki etkisi bilinen bu iki antibiyotik bu çalışmada kullanılmıştır. Yara örtüsü malzemelerinin hazırlanmasında doğal polimerler, sentetik polimerler ya da bunların karışımları kullanılmaktadır. Doğal polimerler biyouyumlu, biyobozunur oldukları ve hücrelerde toksik etkiye neden olmadıkları için yaygın olarak kullanılırlar. Kitosan, yara iyileşmesindeki olumlu etkilerinden dolayı yara örtü malzemesi olarak tercih edilen bir malzemedir. Yara örtüsü hazırlanmasında farklı yöntemler kullanılabilmektedir. Elektroeğirme yöntemi, ıslak çekme ve tuz giderme, liyofilizasyon teknikleri bunlardan bazılarıdır. Liyofilizasyon yöntemi gözenekli yapıda yara örtü malzemeleri üretmek için kullanılır. Bu teknikte, öncelikle çözelti dondurularak buz kristallarinin oluşması sağlanır. Buz kristalleri oluşurken, yoğunlaşan polimer kümeleri oluşturur. Buzun basınç altında süblimleşmesiyle geride gözenekli polimerik iskele kalmaktadır. Salım sistemleri, difüzyon kontrollü, bozunma kontrollü ya da uyarana bağlı kontrollü olabilir. Bu çalışmada pH’ya duyarlı salım sistemi tasarlanmıştır. Yarada enfeksiyon varlığı/yokluğu/aşamasına bağlı olarak derinin pH değeri asidikten (normal, pH 5) bazik değerlere (enfekte, pH 8) değişmektedir. Böyle bir durumda enfeksiyonun önlenmesi için pH artışına bağlı olarak daha fazla antibiyotik salımı yapan sistem kullanmak avantajlı olacaktır. Bu çalışmanın amacı, pH’ya duyarlı antibiyotik salımı yapabilen çift katmanlı yara örtüsü geliştirilmesidir. Bu amaçla, yeni bir yaklaşımla antibiyotik, tip B jelatin mikrokürelerin içine enkapsüle edilmiş ve hazırlanan mikroküreler doğal bir polimer olan kitosan ile hazırlanmış çift katmanlı süngerin içine yerleştirilmiştir. Literatürde antibiyotik salımı yapan yara örtü malzemelerinde antibiyotik doğrudan örtü malzemesine emdirilmiş olup, ilacın büyük bir bölümü hızlıca salınmaktadır. Yapılan tasarımda ikinci bir salım sisteminin yerleştirilmesi ilacın daha uzun süre boyunca salınmasını sağlamıştır. Ayrıca, pH’ya duyarlı polimer olan jelatinin seçilmesi pH’ya duyarlı salım profilinin elde edilmesini sağlamıştır. İki katlı süngerlerin yapımına tek katlı süngerlerin optimizasyonu ile başlanmıştır. Bu amaçla ilk olarak faklı konsantrasyonlarda (%1, %2, %3) karidesten elde edilmiş kitosan solüsyonları hazırlanmış ve iki farklı öndondurma sıcaklığında (-20C ve -80C) dondurularak liyofilize edilmiştir. Her üç konsantrasyon içinde -20C öndondurma koşulunda gözenekli yapılar elde edildiği için çalışmalara bu dondurma sıcaklığında devam edilmiştir. İki katlı süngerlerin hazırlanması için de iki farklı yöntem denenmiştir. İlk yöntemde ilk katman liyofilize edildikten sonra daha yoğun olan üst katman (%4’lük kitosan) dökülerek dondurulup liyofilize edilmiştir. Diğer yöntemde ise ilk katman dondurulup üzerine ikinci katman dökülerek iki dondurma aşamasından sonra tek liyofilizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. SEM görüntüleri incelendiğinde, ilk metodla hazırlanan örneklerde ara bir katman yapısının oluştuğu görüldüğünden, örnekler tek liyofilizasyon yöntemiyle hazırlanmıştır. Buna ek olarak kitosan kaynağının etkisini görmek üzere yengeçten elde edilen kitosan üst katmanın hazırlanmasında kullanılmıştır, çünkü tek katman olarak hazırlanan örneklerde oldukça yoğun ve ufak gözenekli sünger yapısına sahip olduğu görülmüştür. Üst katmanın hazırlanmasında %1’lik yengeç kaynaklı kitosan kullanılmış, farklı glutaraldehit konsantrasyonlarıyla çapraz bağlanmış ve %1 glutaraldehit ile hazırlanan örneklerin şişme testlerinde dağılmadan kaldığı görülmüştür. Hazırlanan çift katlı süngerin SEM görüntüleri incelendiğinde gözenekli alt katman ve yoğun üst tabaka elde edildiği görülmüştür. Köpüklerin şişme testleri farklı tampon çözeltiler kullanılarak yapılmış, bazik tamponlarda şişmenin daha fazla olduğu görülmüştür. Bazik tamponlarda stabilitenin arttırılması için kitosan köpükler 0,1M NaOH çözeltisiyle muamele edilmiştir. Yapılan şişme testlerinde, her iki pH değerinde de (4,5 ve 8,0) NaOH ile muamele edilmeyen köpüklere göre daha az şişme gözlemlenmiştir. Ayrıca, kitosan köpüklerin iki haftadan uzun bir süre bazik tampon çözeltide dağılmadan kaldığı görülmüştür. 0,1M NaOH çözeltisiyle muamele edilmiş köpüklerin SEM görüntüleri incelendiğinde gözeneklerin daha sıkı yapılandığı görülmüştür. Mikrokürelerin hazırlanmasında yağ içinde su emülsiyon tekniği kullanılmıştır. Mikrokürelerden antibiyotik salım testlerinde gentamisin ve siprofloksasin kullanılmıştır. Gentamisin kullanıldığında her iki çapraz bağlayıcı oranında da (%1 ve %2,5) pH 4,5 da salınan ilaç miktarının pH 8,0 de salınan ilaç miktarından fazla olduğu görülmüştür. Ancak siprofloksasin ile hazırlanan mikrokürelerde pH 8,0 de daha fazla ilaç salım profili elde edilmiştir. Siprofloksasin içeren mikrokürelerde farklı çapraz bağlayıcı oranları (%1, %2,5 ve %5) denemiş ve seçilen %2,5 çapraz bağlayıcı oranında yüklenen ilaç miktarının etkisi çalışılmıştır. Ancak yüklenen ilaç miktarındaki artış (3 kat), sadece ani salım miktarını arttırmış fakat salım profilinde değişikliğe neden olmamıştır. Buna ek olarak, salımın gerçekten pH dan etkilendiğini göstermek için pH 4,5 tamponuyla başlatılan salım, 48. saatin sonunda pH 8,0 tampon çözeltisiyle değiştirilmiştir. Elde edilen grafikte pH 8,0 tamponunda devam edildiğinde ilaç salımında artış olduğu görülmüş ve elde edilen sistemin pH’dan etkilendiği bir kez daha gösterilmiştir. Tüm sistemin oluşturulmasında alt katman olarak %0,5 glutaraldehit ile çapraz bağlanarak dayanıklılığı artırılmış %2’lik kitosan çözeltisi kullanılmış ve pH’ya bağlı salım profilinin elde edildiği %2,5 glutaraldehit ile çapraz bağlanmış mikroküreler bu faza eklenerek dondurulmuştur. Üst katman ise %1 glutaraldehit ile çapraz bağlanmış %1 kitosan çözeltisi ile hazırlanmıştır. Entegre sistemin iki model mikroorganizma (gram negatif Pseudomonas aeruginosa ve gram pozitif Staphylococcus aureus) ile yapılan antimikrobiyal aktivite testlerinde antibiyotik salımını başarılı bir şekilde gerçekleştirdiği görülmüştür.

In this work, a smart wound dressing system was designed in two-layer format that includes pH responsive gelatin microspheres for controlled antibiotic delivery. Both layers were prepared using natural polymer chitosan that is obtained from different sources. Bottom layer was designed to have porous structure, which can absorb excess fluid, and dense upper layer was designed for mechanical protection. Gelatin microspheres, on the other hand, were physically incorporated into these two-layer sponges. Firstly, optimization of the chitosan sponges was done. Porous structure was obtained only with chitosan solutions prefreezed at -20C. For construction of two-layer sponges two successive prefreezing were applied in which firstly bottom layer was poured and freezed, and then upper dense layer was poured and second freezing was performed. Bottom layer of chitosan sponge was prepared with 2% shrimp derived chitosan crosslinked with 0.5% glutaraldehyde, and upper layer was prepared with 1% crab derived chitosan crosslinked with 1% glutaraldehyde. Swelling studies showed that two-layer sponges swell more in basic pH values compared to acidic ones. Further stability in basic buffers was obtained after NaOH treatment of the constructed two-layer sponges. Microspheres were prepared with type B gelatin (15%) using different crosslinker concentrations and they were examined under both light and electron microscopes. It was seen that size of the microspheres were within the range of 10-40 m. Release experiments were conducted in two different buffer solutions at different pH values (pH 4.5 and 8.0). The release behavior of two different antibiotics, namely gentamicin and ciprofloxacin, was studied at the given pH values. Ciprofloxacin was chosen for further experiments because its release rate was found to increase at pH 8.0 compared to pH 4.5. This is the desired release profile since infected wound become alkaline and antibiotic release is then needed to deal with bacteria causing that. After in vitro release experiments, microspheres crosslinked with 2.5% glutaraldehyde was chosen for further experiments. It was seen that increase in the loaded drug amount (300 ug/mL instead of 100 ug/mL) does not affect the cumulative release profile. In addition, to demonstrate how the release rate responds to the changing pH conditions, acidic release medium was changed after 48 hours to the basic one, and the change in cumulative release was observed. It was seen that release profile of the ciprofloxacin was affected from the pH change and the release profile was shifted to the one obtained at pH 8.0. Finally, whole system was proved to be successful for its efficiency in antimicrobial activity for model gram positive (Staphylococcus aureus) and gram negative (Pseudomonas aeruginosa) microorganisms.