Biyomineralizasyonu Tetikleyen, Fonksiyonel Ve Biyobozunur Bir Kemik Doku Mühendisliği İskelesi Yapımı

Abstract

Yaşanılan birtakım kazalar, yaralanmalar ya da hastalıklar, insan vücudunda çeşitli doku kayıplarına, deformasyonlara sebep olabilmektedir. Bu doku kayıplarının rejenerasyonu uzun zaman alabilmekte ve eski yapının oluşmasında zorluklar ortaya çıkabilmektedir. Bu problemlerin çözümü için çeşitli biyomalzemeler kullanılmaktadır. Her geçen yıl gelişen ve çeşitlenen biyomedikal çalışmalarında ilk zamanlarda metal, alaşım protezler, plaklar, vidalar ve seramik malzemeler kullanılırken son yıllarda polimerler daha sık tercih edilmektedir. Bunlara ek olarak canlı hücrelerin ve çeşitli doğal ve sentetik polimerlerin birlikte kullanımını içeren doku mühendisliği son zamanlarda araştırmacıların odak noktası haline gelmiştir. Doku rejenerasyonuna yardım ve destek için sıkça kullanılan metal, alaşım vb. malzemeler ile doku onarımı daha uzun sürede gerçekleşmekte ve hasta için ikinci bir operasyonu gerektirmektedir. Buna kıyasla çeşitli kaynaklardan elde edilen polimer malzemeler, doğal doku yapısı ile daha fazla benzer özellik taşıdığı ve kolayca modifiye edilebildiği için daha sık kullanılmaya başlamıştır. Polimerler; doğal kaynaklardan elde edilen (kitosan, jelatin, fibroin vb.) ve çeşitli kimyasal sentez yöntemleri ile üretilen sentetik polimerler olarak iki sınıftan oluşmaktadır. Çeşitli çalışmalar, yeni dokunun oluşum sürecinde implante edilen polimerik malzemelerin biyobozunurluk, biyouyumluluk, toksik olmama gibi özellikleri ile rejenerasyonunu daha kısa sürede geliştirdiğini göstermektedir. Doku mühendisliğinde polimerler çeşitli formlarda kullanılmaktadır. Nanofiber, sünger, mikroküre, film gibi birçok formlar doku rejenerasyonu için denenen bazı formlardır. Sert doku mühendisliğinde daha sık kullanılan polimerik sünger yapılarının, istenen özellikleri kazandırma amacıyla mikroküre, nanofiber gibi diğer formlar ile kompozisyonu yapılabilmektedir. Doku çeşidine göre değişen özellikleri kazandırma amacıyla, farklı polimerler farklı konsantrasyonlarda bir araya getirilerek çeşitli kompozit yapılar ve doğal yapıya benzer mikroçevreler oluşturulmaktadır. Çeşitli kırıklar, deformasyonlar sonucu zarar gören kemik dokusu uzun sürede rejenere olmaktadır. Kemik yapısında bulunan osteopontin, osteokalsin gibi proteinler ile organik ve anorganik kısımların sentezi, doku onarımında önemli bir süreçtir. Kemiğin majör bileşeni olan anorganik kısımdaki hidroksiapatit yapısının oluşumu, kemik rejenerasyonundaki en önemli süreçlerden biridir. Bu sebeple kemik doku mühendisliğinde sadece hücre tutunması, proliferasyonu ve göçünün sağlanması değil, hidroksiapatit yapısının kemiğe benzer şekilde oluşması için uygun doku mühendisliği iskelelerinin hazırlanması gereklidir ve ancak bu şekilde doku onarım süreci hızlandırılabilmektedir. xxiv Kemik doku mühendisliğinde oluşturulan polimerik doku iskelelerin birtakım spesifik özellikleri taşıması gerekmektedir. Biyouyumlu, toksik olmama, kontrol edilebilir bozunma süreci, gözenekli yapı gibi özellikleri ile birlikte osteokondüktif, osteoindüktif ve osteojenik yapıda olmaları gerekmektedir. İstenen bu özelliklerdeki doku iskeleleri için genellikle birden fazla polimer ile kompozit yapılması ya da yüzey modifikasyonları gibi teknikler ile polimerlerin özelliklerinin geliştirilmesi gerekmektedir. Doku mühendisliğinde çeşitli peptit dizileri fiziksel ve kimyasal yollar ile polimer doku iskelelerinin yüzeylerine immobilize edilmekte ve bu şekilde hücre tutunması ve proliferasyonlarını arttırmak mümkün olmaktadır. Bunların yanında kemik doku mühendisliğinde hidroksiapatite bağlanabilen ya da bu tür mineralleşmeyi tetikleyebilen bazı peptit dizileri de kullanılabilmektedir. Bu peptit dizilerinin immobilizasyonu ile biyomineralizasyon süreci hızlandırılmakta, minerallerin kemiktekine benzer şekilde oluşması sağlanabilmekte ve osteoblast hücrelerin tutunması arttırılmaktadır. Böylece hidroksiapatit bileşenin hızlı oluşumu sonucu kemik doku rejenerasyonu daha kısa sürede gerçekleşmektedir. Kemiğin yapısında bulunan en önemli proteinlerden biri olan osteokalsin proteini, 44 amino asit dizisine sahiptir. Bir çalışmada osteokalsin protein dizisinden hidroksiapatit yapılarına bağlanabilme özelliğine sahip 13 amino asitlik bir peptit dizisi kullanılmıştır. Bu peptit dizisinin, OSC ve OSN olarak sırasıyla serbest uç (hidroksil) ve amin grubu ile biten formları çalışılmıştır. OSN peptit dizisinin biyomineralizasyonu kısa sürede arttırdığı bilinmektedir. Bu peptit dizisi ile ilgili çalışmalar sadece paslanmaz çelik yüzeyleri ile sınırlı olduğundan polimer yüzeylerde davranışı bu tez çalışması ile araştırılmıştır. Islak çekme, tuz giderme, faz ayrımı, gaz köpüklendirme ve dondurarak kurutma gibi teknikler üç boyutlu doku iskeleleri üretiminde kullanılmaktadır. Doku iskelesinin gözeneklilik özelliğini şekillendiren en önemli etkenlerden biri de üretim teknikleridir. Bu üretim tekniklerinde birtakım koşullar değiştirilerek değişik gözeneklilik ve mekanik özellikler elde edilebilmektedir. Bu çalışmada doğal ipek fibroin protein (SF) ve sentetik poli(l-laktik asit) (PLLA) polimeri ile 3% w/v konsantrasyonlarda kompozit doku iskeleleri oluşturulmuştur. Liyofilizasyon yöntemi ile yalıtım malzemesi kullanılarak gözenekli doku iskeleleri oluşturulmuştur. Yalıtım malzemesinin gözenekli yapı oluşumundaki etkisi incelenmiştir. Liyofilizasyon ardından metanol ile muamele edilerek fibroin yapısındaki düzensiz kıvrımların (random coil) beta-tabakalı konfigürasyonlara dönüşümü sağlanmıştır. HAp oluşumunu hızlandırmak için osteokalsin proteininden elde edilen OSN peptit dizileri kullanılmıştır. Ardından doku iskeleleri, su alma kapasiteleri, biyobozunurluk, biyomineralizasyon ve hücre çoğalması testleri ile incelenmiştir. SF:PLLA (1:3 w/w) ve SF:PLLA (3:1 w/w) doku iskelelerinin su alma kapasitelerinin %400’den fazla olduğu tespit edilmiştir. Yüksek konsantrasyonda fibroin içeren doku iskelelerinin diğer doku iskelelerine göre daha yüksek su tutma kapasiteleri olduğu (neredeyse iki katı kadar) görülmüştür. Bozunurluk testi, iki ay süresince yapılmıştır. Proteaz XIV enziminin (0.1U/mL) fibroin proteininin bozunmasındaki etikisi gözlemlenmiştir. İki ay sonunda SF:PLLA (1:3 w/w) ve SF:PLLA (3:1 w/w) doku iskelelerindeki kalan ağırlık oranlarının enzim varlığında ve enzim olmadan %50’den fazla olduğu gözlemlenmiştir. SF:PLLA (3:1 w/w) doku iskelelerinde enzim varlığında daha fazla bozunma olmuştur. FTIR spektrumlarına göre iki çeşit doku iskelesinde de metanol etkisi görülmüştür. SF:PLLA (1:3 w/w) doku iskelelerinde proteinin amid I ve amid II bölgelerinde SF:PLLA (3:1 w/w) doku iskelelerinde ise sadece amid I bölgesinde absorpsiyon piklerinin metanol etkisi ile farklı dalgaboylarında oluştuğu görülmüştür. Fibroin proteininin metanol ile etkileşimi ardından beta tabakaları yapılarının artışı sağlanarak suda çözünmeyen doku iskeleleri elde edilmiş ve sonraki analizlerde kullanılmıştır. Mineralizasyon testi bir ay sürecinde SBF içinde uygulanmış ve bu süreçte doku iskelelerinin ağırlık değişimleri gözlemlenmiştir. Solüsyonda apatit kristallerinin oluşumu ve polimerlerin bozunması eş zamanlı olduğundan polimerlerdeki ağırlık değişimi sadece mineral oluşumu hakkında bilgi vermemektedir. Bununla beraber 3xmSBF konsantrasyondaki solüsyonda bir ay boyunca inkübe edilen doku iskelelerin ağırlıklarında azalma gerçekleşmiştir. Diğer yandan, 1xmSBF solüsyonunda inkübe edilen doku iskelelerin bir ay sonunda ağırlıklarında artış görülmüştür. Fakat, peptit immobilizasyonunun doku iskelelerinde ağırlık değişimlerine bir etkisi gözlemlenememiştir. SEM görüntüleri ve atomik Ca/P oranları, mineralizasyonun 2, 3 ve 4. haftalarındaki örnekler üzerinden elde edilmiştir. SEM görüntülerine göre, örneklerin 1x ve 3xmSBF solüsyonlarında 2.hafta inkübasyonu ardından peptit içeren ve içermeyen formlarında mineral oluşumu gözlemlenmiştir. 1xmSBF solüsyonunda inkübe edilen doku iskelelerinde Ca/P oranları hesaplanmıştır. 3. ve 4. hafta mineralizasyonu ardından yüzeylerde daha fazla kalsiyum birikimi sonucu kalsifikasyon saptanmıştır. İki çeşit doku iskelesinde de 3.ve 4. haftada mineralizasyon ve ayrıca kalsifikasyonun arttığı görülmüştür. 4. hafta mineralizasyon sonrası 1xmSBF solüsyonundaki peptit içeren SF:PLLA (3:1 w/w) ve 2.hafta mineralizasyon sonrası peptit içeren SF:PLLA (1:3 w/w) doku iskelelerindeki Ca/P oranları hidroksiapatitin sitokiyometrik değerine (1.67) yakın değerlerde bulunmuştur. FTIR spektrumları sadece 3xmSBF solüsyonunda inkübe edilen peptit içermeyen örnekler için alınmıştır. Poli (l-laktik asit) polimerinin karakteristik grupları ile HAp kristallerinin gruplarının benzer bölgelerde olması yüzünden değişimlerin ayırt edilmesi zor olmuştur. Yine de CO3-2, PO4-3, tip A ve B karbonat (CO3HAp) ve OH- gibi HAp kristallerine ait olan grupların absorpsiyon pikleri özellikle mineralizasyonun ilk haftası sonrasında saptanmıştır. Osteoblast hücrelerinin (hFOB) doku iskeleleri üzerindeki tutunmaları, 1, 4 ve 7. günlerdeki MTS analizi ile gözlemlenmiştir. SF:PLLA (3:1 w/w) doku iskelelerinde, SF:PLLA (1:3 w/w) formlarına göre daha fazla hücre tutunması görülmüştür. Ayrıca, peptit dizisi içeren SF:PLLA (1:3 w/w) formların peptit dizisi içermeyen iskelelere göre daha fazla hFOB hücre tutunması gerçekleşmiştir. Ayrıca, SF:PLLA (3:1 w/w) doku iskelelerinde peptit dizisi içeren formlarda daha düşük hücre tutunması gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, mineralizasyon sürecini etkileyelebilecek peptitler kullanılarak liyofilizasyon yöntemi ile kemik yapısına benzer iki farklı konsantrasyonda kompozit doku iskeleleri elde edilmiştir. Peptit immobilizasyonu, mineralizasyon ve hücre tutunmasına etki etmiştir ama her zaman pozitif sonuç alınamamıştır. İleriki çalışmalarda, polimerlerin yüzeyinde peptit dağılımlarını gözlemleyebilmek için işaretli peptit dizileri kullanılabilir. Ayrıca immobilize olan peptitlerin konsantrasyonunun optimizasyonu için HPLC analizi yapılabilir. Ek olarak, kalsiyum birikimini gözlemlemek için von Kossa boyaması uygulanabilir. Sonuç olarak, peptitlerin etkilerini daha iyi anlayabilmek ve optimize edebilmek için daha kapsamlı bir çalışma gerekmektedir.

In case of accidents, injuries or diseases, a various tissue deformations may occur. Tissue regenerations can take a long time and sometimes recovery is not possible completely. The metals, polymers and ceramics are widely used in biomedical field to assist the body to address these problems. Tissue engineering aims to produce tissues by mimicing natural structures with using natural and synthetic polymeric scaffolds. This study aims to obtain composite scaffolds for bone tissue regeneration using silk fibroin and poly(l-lactide) as natural and synthetic polymers. These scaffolds were produced by freeze drying method and insulation cover was used to observe the effect of freezing conditions on properties of scaffolds. After lyophilization process, the scaffolds were treated with methanol to induce beta sheet regions from random coil structures in silk fibroin protein. To induce biomineralization, various peptides can be used. In this study, OSN peptide, which is obtained from osteocalcin protein, was used to promote hydroxyapatite (HAp) crystallization. The scaffolds were characterized with water uptake, biodegradation, biomineralization and cell proliferation tests. The water uptake capacities of scaffolds were found to be higher than 400% for both SF:PLLA (1:3 w/w) and SF:PLLA (3:1 w/w) scaffolds. The samples with high silk fibroin ratio had higher water uptake capacity (almost two fold) compared to other ones. The degradation analysis was carried out for two month. The protease XIV enyzme (0.1U/mL) was used to see its effect on fibroin degradation. After two months, the remaining weight of SF:PLLA (1:3 w/w) and SF:PLLA (3:1 w/w) scaffolds were higher than 50% with and without enzyme. As expected, sample with high SF showed more degradation in the presence of protease enzyme. The effect of methanol treatment on formation of beta sheet structures from random coils were investigated with FTIR analysis by observing shifted peaks at amide I and amide II regions for SF:PLLA (1:3 w/w) and only amide I region for SF:PLLA (3:1 w/w) scaffolds. After methanol treatment, the insoluble structures were obtained with increasing beta sheet formations in fibroin proteins and used for further analysis. The mineralization process was followed for a month and weight changes of scaffolds were reported. Two events simultaneously occur in solution: The formation of apatite crystals and degradation of polymers and weight of scaffolds was affected from both. The scaffolds that were incubated in 3xmSBF solution showed weight loss at the end of a month. On the other hand, the scaffolds incubated in 1xmSBF showed weight gains after a month. The effect of OSN peptides could not be clearly observed from weight change data. The SEM images were taken and the atomic ratios of Ca/P were determined by EDS after 2, 3 and 4th weeks of mineralization process. According to the SEM images, mineral formations can be observed after 2nd week in scaffolds with and without peptides in 1xmSBF and 3xmSBF solutions. The Ca/P ratios were calculated in scaffolds incubated in 1xmSBF solution. The calcification appeared because of the more calcium accumulation after 3rd and 4th weeks of mineralization. The Ca/P ratios of SF:PLLA (3:1 w/w) scaffolds with peptides after 4th week of mineralization and SF:PLLA (1:3 w/w) scaffolds with peptides after 2nd week of mineralization were found to be closer to the stoichiometric value of HAp (1.67). The FTIR spectra were obtained for both scaffolds without peptides incubated in 3xmSBF solution. The presence of characteristic groups of PLLA made diffucult to distinguish the groups of HAp crystals. The few absorption peaks shifted because of the apatite growth on polymer surfaces. The CO32-, PO43-, type A and B carbonate (CO3HAp) and OH- groups that belongs to HAp crystals were obtained on scaffolds especially after 1th week of mineralization according to the FTIR spectra. To investigate the proliferation of human osteoblast cells (hFOB) on composite scaffolds, MTS analysis was applied at 1, 4 and 7 day. The SF:PLLA (3:1 w/w) scaffolds showed higher cell numbers than SF:PLLA (1:3 w/w) scaffolds. Additionally, the SF:PLLA (1:3 w/w) with peptides had more hFOB cells on polymer surfaces than without peptides scaffolds. On the other hand, the SF:PLLA (3:1 w/w) scaffolds with peptides showed less cell proliferation than without peptides forms. In conclusion, the composite scaffolds with two different concentrations were produced by lyophilization process to mimic bone tissue structures and a peptide to direct the mineralization process was added for further improvement. The biodegradability of the scaffolds seemed to be appropriate for bone tissue engineering. Peptide addition affected the mineralization and cell proliferation behavior of the scaffolds but not always in positive manner. For future prospects, the labeled-peptides can be used to obtain the distribution of peptides on the surfaces of polymers. HPLC analysis can be applied to optimize the concentration of immobilized peptides. In addition, the von Kossa staining can be used to observe calcium deposition. In sum, a more comprehensive study is needed to understand and optimize the effect of peptides on the scaffolds surface.