Nfıb Proteininin Potansiyel Bağlanma Partnerleri Olan Atxn3 Ve Mad2b İle Etkileşiminin Araştırılması

thumbnail.default.placeholder
Tarih
2017-03-23
Yazarlar
Yılmazyıldırım, Eda
Süreli Yayın başlığı
Süreli Yayın ISSN
Cilt Başlığı
Yayınevi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Institute of Science and Technology
Özet
Nükleer Faktör I (NFI) ailesi, DNA da özel bölgelere bağlanan bir protein ailesidir. Bu proteinler, viral DNA replikasyonunda ve genlerin ifade edilmesinin regülasyonunda rollere sahiptir. Nükleer faktör I ailesi, transkripsiyon faktörü olarak adlandırılır ve embriyonun gelişimi boyunca önemli genlerin regülasyonunda görevlidir. Bunun yanısıra yetişkin kök hücre nişlerinde de gen regülasyonunda görev almamaktadır. DNA-bağlanma analizi deneyleri ile NFI proteinlerinin DNA üzreinde çift simetrik korunmuş bir dizi bölgesine bağlandığı ortaya çıkarılmıştır. Bu çift simetrik dizi, çift zincirli DNA üzerinde TTGGC(N5)GCCAA sekansı ile bulunmaktadır. NFI proteinleri bu korunmuş bağlanma bölgesine homo ya da heterodimer olarak yüksek ilgiyle bağlanmaktadır. Dört adet olan NFI genleri NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX olarak omurgalılarda, Xenopus türünden insan’a kadar her çalışmada tanımlanmıştır. NFI ailesinin üyesi olan tüm proteinler, N ucunda DNA bağlanma ve dimerizasyon bölgesi ve C ucunda transkripsiyonel aktifleştirme ve susuturma bölgesi adında bilinen kısımları içermektedirler. N ucunda bulunan DNA bağlanma/dimerizasyon bölgesi, NFI genleri arasında güçlü bir şekilde korunmuş bir bölgedir. Bu bölge 200-220 amino asitlik bir büyüklüğü kapsamaktadır. Bu bölge 4 adet sistein kalıntısını içerir ve bu kısım NFI’lardaki tüm DNA bağlanma bölgeleri arasında korunmuştur. Ama bu DNA bağlanma bölgesi helix-turn-helix gibi diğer sınıf iyi tanımlanmış DNA bağlanma bölgeleri ile bir benzerlik göstermemektedir. Ek olarak bu korunmuş bölge, TGF-β sinyal yolağında görevli SMAD proteininde de bulunan MH1 motifini içermektedir. Buna karşılık, prolin bakımından zengin olan C ucu bölgesi, N ucu bölgesi ile karşılaştırıldığında daha az korunmuştur. Bunlara ek olarak, NFI proteinlerinde önemli ölçüde çeşitlilikler C ucu alanında oluşmaktadır. Bu proteinler büyük olasılıkla farklı transkripsiyon kipleme alanlarını kodluyorlar. NFI transkripsiyon faktörlerinin gen anlatım modeli hücre tipine göre değişmektedir. NFI transkripsiyon faktörleri, memeli gelişimi esnasında dokuya özel gen anlatımlarında önemli bir role sahiptir. Özellikle, merkezi sinir sisteminde gen anlatımları önemli bir role sahiptir. Merkezi sinir sisteminde, NFI faktörleri nöral kök hücrelerin farklılışmasını kontrol etmektedir. NFI transkripsiyon faktörlerinin DNA-bağlanma ve gen anlatım regülasyonu aktivitelerinin her ikisi de promotörlerin aktivasyonu ve baskılanması ile ilgilidir. Literatürde, NFI faktörlerinin ve histonların etkileşimleri maya ikili hibrit analizi ile gösterilmiştir. Ayrıca bu etkileşim sonuçları transfekte edilen memeli hücre deneyleri ile doğrulanmıştır. Maya ikili hibrit sistemi ya da Y2H olarak adlandırlan yöntem protein-protein etkileşimlerini keşfetmek için moleküler biyolojide kullanılır. Bu yöntem ile insan cenin beyin cDNA kütüphanesi taranmıştır. Tarama esnasında NFIB yem olarak kullanılmıştır. Bu tarama sonucunda yem olarak kullanılan NFIB ile güçlü bağlanma gösteren proteinler tanımlamıştır. Bu proteinler arasından ATXN3 ve MAD2B potansiyel NFIB bağlanma partnerleri olarak tanımlanmışlardır. Proteinler arasında olası etkileşimi ya da bağlanmayı göstermek için seçilen bu proteinler muhtemel NFIB bağlanma eşi olarak adlandırılmıştır. ATXN3 proteini, poliglutamin protein ailesinin bir üyesidir ve bu protein ailesi dokuz farklı nörolojik dejeneratif bozukluk olarak adlandırılan genetik hastalıklar ile ilişkilendirilmiştir. ATXN3 proteini genel olarak sitoplazmik bir proteindir. Yaygın bir biçimde nöral ve nöral olmayan insan dokularında anlatımı yapılmaktadır.ATXN3 gen anlatımının seviyesi insan beyninin farklı kısımlarında çeşitlilik göstermektedir. İnsan beyninde ATXN3 gen anlatımı, nöranların alt populasyonlarında özgün olarak gözlenmiştir. Ek olarak, ATXN3 proteininin ubikuitin- proteazom sistemi ilişkisi ve transkripsiyon düzenlenmesinde aldığı roller ve etkisi gösterilmiştir. Bu özellikleri, ATXN3 proteininin fizyolojik rolleri olarak adlandırılmıştır. MAD2B bir insan genidir ve MAD2L2 ve Rev7 olarak da adlandırılır. Bu protein, spindle checkpoint geni olarak adlandırlan MAD2 ile homologdur. İnsan homoloğu olan MAD2B, MAD2 (mitotic arrest deficient 2) ile amino asid sekansı bakımından %53 oranında benzerlik göstermektedir. MAD2B, hücre siklusunda spindle assembly checkpoint (SAC) olarak adlandırılan kontrol noktaları için önemli bir aracıdır. MAD2B proteini birçok hücresel fonksiyonlarda yer almaktadır. Bu fonksiyonlardan biri olan hücre siklusu regülasyonunda, Cdc20/Cdh1 proteinlerinde bağlanarak anafaza geçiş kompleksini (APC) inhibe ettiği gösterilmiştir. Bu protein, memeli hücrelerde DNA hasar yanıtında da önemli bir fonksiyona sahiptir. Ek olarak, MAD2B proteini yapısal ve fonksiyonel olarak HORMA domain ile karakterize edilmiştir. Her iki protein de transkripsiyonel regülasyon özellikleri ile gelişimsel süreci düzenlemektedirler. ATXN3 ve MAD2B proteinlerinin yokluğunda yapılan çalışmalar sonucunda, anormal beyin gelişimi ve hücre oluşumu gözlenmiştir. Ayrıca ATXN3 ve MAD2B mutant (-/-) farelerde fenotip incelendiğinde her iki proteinin de gelişimde rol aldığı gözlenmiştir. MAD2B geninin mutant olduğu farelerde, embriyolarında primordial germ hücrelerinin (PGCs) farklılaştıktan sonra kaybolduğunu ve epigenetic tekrar programlanmayı sürdüremedikleri gözlenmiştir. Diğer bir protein olan ATXN3, deubikitinasyon aktivitesi ile sinir sitemi için önemli bir paya sahiptir. ATXN3 mutant (-/-) farelerde yapılan çalışmalarda nöronal fonksiyonel bozukluğu ve nörodejenerasyon gözlenmiştir. Bu çalışmada NFIB ile ATXN3 ve MAD2B etkileşimini gösterebilmek için, birlikte çöktürme ve GST ile çöktürme deneylerini gerçekleştirdik. Bu deneylerin sonucunda, epitope tagli MAD2B, ATXN3 ve NFI proteinleri birlikte anlatımları yaptırıldıktan sonra bağlanmaları birlikte çöktürme deneyi ile analiz edilmiştir. Bu deneylerin sonucunda, MAD2B ve NFIB proteinlerinin birlikte çöktüğünü gözlemledik. İki proteinin de birbirlerini çöktürdüğünü deneyerle karşılıklı olarak göstermiş olduk. Diğer NFI ailesi üyeleri olan NFIA, NFIC ve NFIX protenlerinin MAD2B ile birlikte çökmediği yani bir etkileşimin olmadığını gözlemledik. Bu deneylere ek olarak, mutant NFIB proteinleri ile birlikte çöktürme deneyini gerçekleştirdik. Deneyde kullanılan mutant NFIB proteinleri ya sadece N-ucu olan DNA bağlanma dimerizasyon bölgesini içeriyordu ya da C-ucu transkripsiyon aktifleştirme ve baskılama bölgesini içeriyordu. Deney sonucunda mutant NFIB protinlerinin her ikisi de MAD2B protein ile birlikte çökmedi. Diğer yandan, ATXN3 proteini ve NFI ailesi ile birlikte GST çöktürme deneylerini gerçekleştirdik. GST çöktürme deneyleri sonucunda GST etiketli ATXN3 proteinin hem NFIA hem de NFIB proteinini çektiği gözlenmiştir. Hangi NFIB bölgesinin bağlanmada etkili olduğunu gözlemlemek için, birlikte çöktürme deneyinde de kullanılan NFIB mutant proteinleri kullanıldı. Bu proteinler sadece DNA bağlanma ve dimerizasyon bölgesi olan N-ucu ya da uzatılmış hali olan N-ucu kısımlarından oluşan mutant NFIB ve transkripsiyon aktifleştirme ve baskılama bölgesi olan C-ucunu içeren NFIB proteinleridir. Deney sonucunda hem NFIB_N hem de uzatılmış N terminal kısmı içeren mutant NFIB proteinin (NFIB_E), GST etiketli NFIB protein ile birlikte çöktüğü gözlenmiştir. Sadece C ucu içeren mutant NFIB GST-ATXN3 ile birlikte çökmemiştir. Bu nedenle, yalnızca C ucunun ATXN3 ile etkileşim içn yeterli olmadığı sonucunu çıkarabiliriz. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, NFIB proteinin farklı etkileşim partnerleri tarafından regülasyonu ve dolyısıyla NFI ailesinin nöral gelişimdeki rolünü açıklayabilir.
Nuclear Factor I (NFI) family of transcription factors are site-specific DNA-binding proteins that play roles in viral DNA replication and regulation of gene expression. NFI proteins bind with high affinity to the dyad symmetric consensus sequence TTGGC(N5)GCCAA on duplex DNA as homo or heterodimers. Four NFI genes (NFIA, NFIB, NFIC and NFIX) have been identified in every studied vertebrate species from Xenopus to human. NFIs contain an N-terminal DNA binding and dimerization domain and a C-terminal transcriptional activation and repression domain. The N-terminal DNA-binding/dimerization domain is highly conserved between the four genes and includes an MH1 motif also found in SMAD proteins of the TGF-β signaling pathway. In contrast, the proline rich C-terminal domain is less conserved. Furthermore, C-terminal domain, which encodes the transcription modulation domain, varies among the NFI family members. NFI transcription factors are expressed in a cell-type specific fashion and may regulate in tissue-specific gene expression during mammalian development. NFIA, NFIB, and NFIX are expressed in the ventricular zones in the developing nervous system, and in the adult neural stem cell niches. NFIs can both activate and repress transcription. Previously, a yeast two hybrid screen of a fetal human brain cDNA library using NFIB as bait identified ATXN3 and MAD2B as potential NFIB binding partners. ATXN3 belongs to the family of polyglutamine proteins which are implicated in nine different genetic neurodegenerative disorders. ATXN3 is generally a cytoplasmic protein, widely expressed in neural and non-neural human tissues. ATXN3 has been associated with the ubiquitin–proteasome system as well as transcriptional regulation. MAD2B is also known as MAD2L2 and Rev7 and is homologous to the spindle checkpoint gene MAD2. MAD2B is an important intermediary of the spindle assembly checkpoint. MAD2B is also involved in cell cycle regulation where it was shown to inhibit the Anaphase Promoting Complex (APC) by binding to Cdc20/Cdh1. MAD2B also acts in the DNA damage response in mammalian cells. Moreover, this protein carries the HORMA domain, responsible for protein-protein interactions. Both proteins can regulate developmental processes by transcriptional regulation. In mice that are deficient in MAD2B, primordial germ cells (PGCs) die after being specified due to misregulation of epigenetic reprogramming. Deubiquitinating activity of ATXN3 is critical for the nervous system. ATXN3 null mice exhibit neuronal dysfunction and neurodegeneration. In this study, in order to explore interactions between NFIB and ATXN3 or MAD2B, we performed co-immunoprecipitation experiments and GST pull down assays. To this end, epitope tagged MAD2B, ATXN3 and NFIs were overexpressed in HEK293T cells and binding was assessed via co-immunoprecipitation. We found that MAD2B and NFIB could be co-immunoprecipitated with each other. Other NFI family members (NFIA, NFIC, NFIX) did not appear to bind MAD2B. In addition of these, we also testing for binding of several mutant NFIB constructs that comprise only the NFIB N-terminal DNA binding and dimerization domain (NFIB_N) or C-terminal transactivation-repression domain (NFIB_C) to MAD2B. Both mutant NFIB proteins could not precipitate with MAD2B. On the other hand, ATXN3 did not co-immunoprecipitate with NFIB and NFIB did not co-immunoprecipitate with ATXN3. Therefore, we analyzed binding of these proteins using an alternative approach, the Glutathione-S transferase (GST) pull down assay. GST pulldown experiments with NFIs and ATXN3 showed that ATXN3 pulled down NFIA and NFIB. To find out which NFIB domains are required for ATXN3 binding, we performed GST pulldown experiments using NFIB mutants. Once again these mutants constructs were NFIB_C, NFIB_N and lastly, NFIB_E which encodes for NFIB DBD-engrailed repressor fusion protein. Preliminary data indicate that GST-ATXN3 precipitated NFI_N and NFIB_E but not NFIB_C. We, therefore, surmised that NFIB may interact with ATXN3 through its N terminal domain in these experiments. Further experiments that examine these interactions in vivo are required to verify these results. NFIB and binding partner domains that are involved in these putative interactions can then be dissected by site-directed mutagenesis. To conclude that the obtained results from this study will enlighten the regulation of NFIB by different interaction partners that will lead to revealing the role of NFI family in neural development.
Açıklama
Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2017
Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2017
Anahtar kelimeler
ATXN3, MAD2B, NFIB, Interaction Partner, ATXN3, MAD2B, NFIB, Interaction Partner
Alıntı