Kpkt Katil Toksininin Saccharomyces Cerevisiae Ve Pichia Pastoris Hücrelerinde Heterolog Üretimi İçin Ekspresyon Vektörlerinin Oluşturulması

Abstract

Mikroorganizmalar, doğada sınırlı besin koşullarında hayatta kalabilmek için diğer mikroorganizmalarla mücadele halindedirler. Bu yüzden, farklı savunma mekanizmaları geliştirerek diğer türlere karşı üstünlük kurmaya çalışırlar. Katil mayalar, bu savunma mekanizmalarından birine sahiptirler. Bu özel maya türleri protein ya da glikoprotein şeklinde katil toksinler sentezlerler. Bu ürettikleri katil toksinleri hücre dışı ortama çıkararak bu toksinlere karşı dirençli olmayan mikroorganizmaların ölmesine neden olurlar. Katil toksinler aktivitelerini ancak o toksine karşı dirençli olmayan mikroorganizmalarda bulunan spesifik reseptörlere bağlanarak gösterirler. Bu reseptörler katil toksin reseptörleri olarak adlandırılır. Katil mayalar, kendi ürettikleri toksinlere karşı dirençlidir. Fakat dirençli olmayan mikroorganizmalarda genellikle iki aşamalı bir mekanizmayla sitosidal etkilerini gösterirler. İlk olarak dirençli olmayan mikroorganizmaların hücre duvarındaki çeşitli bileşenlere bağlanarak hücreyi öldürebilirler veya hücre membranına geçerler. Hücre duvarında bulunan bu reseptörler birincil katil toksin reseptörleri olarak adlandırılır. İkinci aşamada ise hücre membranı üzerindeki bileşenlere bağlanıp sitosidal etkilerini gösterebilecekleri gibi hücre içine geçerek de hücrelerin ölümüne neden olabilirler. Hücre membranı üzerinde bulunan bu reseptörler ise ikincil katil toksin reseptörleri olarak bilinir. Katil toksinler farklı etki mekanizmalarına sahiptir ve bu etki mekanizmaları genetik belirleyicilere ve katil toksinlerin fiziko-kimyasal özelliklerine bağlıdır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, katil toksinlerin endüstriyel ve terapötik alandaki potansiyel kullanım alanları gösterildiğinden, bu toksinler önemli bir yere sahip olmaya başlamıştır. Bu toksinlerin gıda koruyucusu, alkol fermentasyonunda biyo-kontrol ajanı, kemoterapötik ve antibakteriyel ajanlar olarak kullanımı ileriki yıllarda hedeflenmektedir. Kpkt katil toksini son yıllarda endüstriyel bir potansiyele sahip olması nedeniyle önem kazanmıştır. Kpkt katil toksini Tetrapisispora phaffii (önceden bilinen adıyla Kluyveromyces phaffii) tarafından üretilmektedir. Bu toksin, şarapların bozulmasına neden olan mayalar üzerinde etkili olduğu için alkol fermentasyonunda potansiyel bir kullanım alanına sahiptir. Kpkt, özellikle Kloeckera apiculata ve Hanseniaspora uvarum türleri üzerinde ölümcül etkiye sahiptir. Ayrıca şarap fermentasyonu sırasında 14 günden fazla süreyle etkisini gösterebildiğinden değerli bir toksindir. Kpkt toksini, bir glikoproteindir ve β-glukanaz aktivitesine sahiptir. Sitosidal aktivitesini ise bu toksine dirençli olmayan mayaların hücre duvarlarında bulunan β-1,3- ve β-1,6- glukanları hidrolize ederek gösterir. Kpkt, T. phaffii tarafından TpBGL2 geni ile ifade edilir. Bu çalışmanın amacı, Kpkt katil toksinini heterolog olarak Saccharomyces cerevisiae ve Pichia pastoris’te üretebilmek için ekspresyon vektörlerinin oluşturulmasıdır. Bu amaçla iki farklı ekspresyon vektörü kullanılmıştır. pYES2.1/V5-His-TOPO® vektörü Kpkt katil toksininin S. cerevisiae’de hücre içi ve hücre dışı üretimi için kullanılmışken, pPIC9 vektörü bu toksinin P. pastoris’te hücre dışı üretimi amaçlanarak kullanılmıştır. Çalışmanın ilk bölümünde, Kpkt’nin heterolog üretimi için bu toksine karşı dirençli uygun S. cerevisiae ve P. pastoris suşları seçilmiştir. Bunun için S. cerevisiae BY4741 ve YPH501 suşları ile P. pastoris GS115 suşları tercih edilmiştir. Tüm suşlar, sitrat-fosfat tampon çözeltisi (pH 4.6) içeren katı besiyerlerine ayrı ayrı ekilerek Kpkt’ye karşı dirençleri gözlemlenmiştir. P. pastoris GS115 suşu bu toksine karşı güçlü bir direnç gösterdiğinden sonraki çalışmalarda heterolog üretim için tercih edilmiştir. S. cerevisiae BY4741 ve YPH501 suşları ise galaktoz içeren besiyerlerinde ayrı ayrı büyütülerek büyüme profilleri gözlemlenmiştir. Daha sonraki aşamada transformasyon için pYES2.1/V5-His-TOPO® vektörü kullanıldığından ve bu vektör sadece galaktoz varlığında indüklenen GAL1 promotörüne sahip olduğundan, galaktoz varlığında üreyebilen suş seçilmeye çalışılmıştır. Sonuç olarak, BY4741 transformasyon için uygun S. cerevisiae suşu olarak seçilmiştir. Bu çalışmada üç farklı vektör dizayn edilmiştir: i) GAL1 promotörü kontrolünde TpBGL2 genini içeren pYES2.1/V5-His-TOPO® vektörü; ii) GAL1 promotörü kontrolünde ve α sekansı sonrası TpBGL2 geni içeren pYES2.1/V5-His-TOPO® vektörü; iii) AOX1 promotörü kontrolünde ve α sekansı sonrası TpBGL2 geni içeren pPIC9 vektörü. Bu vektörleri oluşturmak için ilk olarak T. phaffii’nin total DNA’sı izole edilmiştir. Daha sonra, elde edilen total DNA’nın kalitesini belirlemek amacıyla evrensel primerler olan ITS1 ve ITS4 kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile bu primerlere spesifik olan kısım çoğaltılmıştır ve elde edilen total DNA sonraki PZR amplifikasyonları için kullanılmıştır. S. cerevisiae’da Kpkt’nin hücre içi üretimi amacıyla ilk vektörü (GAL1 promotörü kontrolünde TpBGL2 genini içeren pYES2.1/V5-His-TOPO® vektörü) oluşturmak için, T. phaffii total DNA’sından TpBGL2 geni BGL2F ve BGL2R primerleri kullanılarak PZR ile çoğaltılmıştır. Daha sonra bu gen pYES2.1/V5-His-TOPO vektörüne ligasyon ile yerleştirilmiştir. Ligasyondan sonra vektörler ilk olarak Escherichia coli hücrelerine klonlanmıştır ve vektörler E. coli hücrelerinden izole edilmiştir. Elde edilen vektörlerde TpBGL2 geninin hem varlığını belirlemek hem de düzgün oryantasyonda yerleştiğini anlamak amacıyla ilk olarak MlyI ve XbaI enzimleri ile kesilmiştir. Buna ek olarak, vektörler GAL1 ve BGL2R primerleri ile çoğaltılmıştır ve sekanslama analizinin sonuçlarıyla birleştirilerek TpBGL2 geninin vektörlere doğru oryantasyonla girdiği doğrulanmıştır. İkinci ve üçüncü vektörleri oluşturmak için ise ilk olarak TpBGL2 geni 5’ ucundan ve 3’ ucundan sırasıyla EcoRI ve NotI restriksiyon kesim bölgelerine sahip olacak şekilde FW2 ve RV2 primerleriyle PZR ile çoğaltılmıştır. EcoRI ve NotI restriksiyon kesim bölgeleri içeren TpBGL2 geni ilk olarak pGEM-T vektörüne ligasyon ile yerleştirilmiştir ve E. coli hücrelerinde klonlanmıştır. Ardından vektörler izole edilmiştir ve TpBGL2 geninin vektörlerdeki varlığını belirlemek amacıyla EcoRI ile restriksiyon kesimi yapılmıştır. Daha sonra, hem boş pPIC9 vektörleri hem de TpBGL2 geni içeren pGEM-T vektörü EcoRI ve NotI enzimleri kullanılarak kesilmiştir. Restriksiyon ürünleri ligasyon ile birleştirilmiştir ve üçüncü vektör (AOX1 promotörü kontrolünde ve α sekansı sonrası TpBGL2 geni içeren pPIC9 vektörü) elde edilmiştir. Bu vektörde TpBGL2 geninin doğru oryantasyonda olduğunu belirlemek amacıyla PZR kullanılarak AOX1 ve BGL2R primerleri ile amplifikasyon yapılmıştır. Sekanslama sonuçları da hedef genin doğru oryantasyonla vektör içerisine girdiğini doğrulamıştır. Ardından ikinci vektörü (GAL1 promotörü kontrolünde ve α sekansı sonrası TpBGL2 geni içeren pYES2.1/V5-His-TOPO® vektörü) oluşturmak için TpBGL2 geni α sekansı ile birlikte ALFA ve BGL2R primerleri kullanılarak PZR ile çoğaltılmıştır. Elde edilen PZR ürünleri pYES2.1/V5-His-TOPO® vektörüne klonlanmıştır. Daha sonra, vektör içerisindeki oryantasyonunu belirlemek amacıyla sekanslama analizi yapılmıştır. Sekanslama sonucunda insert’in vektör içerisinde yanlış oryantasyonda olduğu belirlenmiştir. Bu yüzden, sonraki çalışmalarda bu vektör kullanılmamıştır ve maya hücrelerine transformasyon için elde edilen üç vektörden diğer ikisi kullanılmıştır. Kpkt’nin hücre içi üretimi için tasarlanan pYES2.1/V5-His-TOPO® + TpBGL2 vektörü S. cerevisiae BY4741 suşuna transforme edilmiştir. TpBGL2 geninin S. cerevisiae transformantlarındaki varlığı total DNA ekstraksiyonundan sonra PZR ile doğrulanmıştır. Seleksiyon işlemi urasil içermeyen minimal katı besiyerinde yapılmıştır. Elde edilen altı S. cerevisiae transformantından bir tanesi (T1) Kpkt’nin aktivitesini incelemek amacıyla kullanılmıştır. Bu amaçla, T1 ilk olarak %2 galaktoz ve %2 rafinoz içeren tampon çözeltili (pH 4.6) minimal besiyerinde büyütülmüştür. Hem 24 saat sonra hem de 48 sonra örnek alımı yapılmıştır ve hücrelerin hem kaba özütü hem de üst fazı (süpernatantı) elde edilmiştir. Bu örnekler S. cerevisiae DBVPG 6500 (Kpkt’ye karşı hassas suş) ile ekilmiş katı besiyerinde oluşturulan kuyucuklara aktarılmıştır ve Kpkt katil toksininin varlığı hassas suşa karşı aktivitesine bakılarak belirlenmiştir. İkinci olarak T1, %0.2 galaktoz ve %2 rafinoz içeren minimal besiyerinde büyütülüp %2 galaktoz içeren minimal besiyerine aktarılmıştır. Tekrar örnekleme yapılıp katı besiyerinde aktivitesine bakılmıştır. Son olarak T1 %2 sükroz içeren seçici besiyerinde inkübe edildikten sonra, %2 galaktoz içeren minimal besiyerine aktarılmıştır ve hem kaba özüt için hem de üst faz için örnekleme yapılarak katı besiyerinde Kpkt’ye hassas suş üzerindeki aktivitesine bakılmıştır. Tüm büyüme stratejileri sonucunda yapılan testlerde, Kpkt’nin hücre içi üretimi durumunda sitosidal aktivitesini gösteremediği belirlenmiştir. Son olarak, Kpkt’nin P. pastoris’te hücre dışı üretimi amacıyla üçüncü vektör (PIC9 + TpBGL2) elektroporasyon ile P. pastoris GS115 suşuna transforme edilmiştir. İlk olarak P. pastoris hücreleri kompetan hücre elde etmek amacıyla hazırlanmıştır. Daha sonra, hem insert içeren hem de boş pPIC9 vektörleri SacI ya da BglII enzimi kullanılarak lineerize edilmiştir ve lineerize edilen vektörler transformasyonda kullanılmıştır. Seleksiyon minimal dekstroz besiyerinde yapılmıştır. Ardından elde edilen transformantlar hem minimal dekstroz hem de minimal metanol katı besiyerlerinde ayrı ayrı üretilmiştir ve Mut+ (metanol kullanabilen) ile MutS (metanol kullanımı yavaş) fenotiplere aday transformantlar belirlenmiştir. Alkol oksidaz enzimini ifade eden AOX1 geni transformasyon sonrası fonksiyonel olması durumunda Mut+ fenotipi gözlemleneceğinden fenotip testi yapılmıştır ve ek olarak PZR amplifikasyonu yapılarak insert içeren transformantlar belirlenmiştir. Kpkt katil toksininin P. pastoris’te üretildikten sonraki sitosidal aktivitesi ile ilgili çalışmalar devam etmektedir.

In nature, microorganisms process several defense mechanisms to survive under limited nutritional conditions. Killer yeasts have one of the defense mechanisms. They produce toxins called killer toxins (KTs) against sensitive microorganisms. Killer toxins are produced by killer yeasts into extracellular environment and they show their activities by binding to specific compounds called killer toxin receptors (KTRs). Killer toxins can be produced as either proteins or glycoproteins. While killer yeasts have self-immune system to their own KTs, their cytocidal activities usually process in a two-step mechanism on sensitive strains. In the first step, they bind the receptors on cell-wall of the sensitive strains. These receptors are known as primary KTRs. Secondary KTRs found on cell membrane are the second targets of KTs. They bind to these receptors to kill the sensitive strains to enter the cell. Different action mechanisms have been presented for killer toxins and they depend on the genetic determinants as well as physical-chemical properties of KTs. Kpkt is one of the killer toxins produced by Tetrapisispora phaffii (formerly known as Kluyveromyces phaffii). Kpkt killer toxin is active against wine spoilage yeasts such as Kloeckera apiculata and Hanseniaspora uvarum. Therefore, Kpkt has a potential to be used in wine fermentation since it maintains its zymocidal activity for more than 14 days in wine. Kpkt is a glycoprotein and it has a β-glucanase activity. It shows its activity by hydrolyzing β-1,3- and β-1,6- glucans on cell-walls of the sensitive strains. Kpkt killer toxin is encoded by TpBGL2 gene in T. phaffii. The aim of the study was to construct expression vectors for heterologous production in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris. For this purpose, pYES2.1/V5-His-TOPO® vector was utilized for both extracellular and intracellular production in S. cerevisiae as well as pPIC9 vector was utilized for extracellular production in P. pastoris. In the first part of the study, suitable yeast strains resistant to Kpkt were selected for heterologous production of Kpkt. S. cerevisiae YPH501 and BY4741 along with P. pastoris GS115 strains were subjected to killer plate assay using YPD plates containing citrate-phosphate buffer (pH 4.6). P. pastoris GS115 appeared as a suitable strain after this plate assay. Then, S. cerevisiae YPH501 and BY4741 were grown in galactose containing media to observe their growth profiles in galactose containing media since pYES2.1/V5-His-TOPO® vector harbors GAL1 promoter which is active only in the presence of galactose. Finally, BY4741 was selected as a suitable strain for transformation. In this study, three different vectors were constructed: i) TpBGL2 gene in pYES2.1/V5-His-TOPO® under the control of GAL1 promoter; ii) TpBGL2 gene in pYES2.1/V5-His-TOPO® under the control of GAL1 promoter and downstream the  sequence; iii) TpBGL2 gene in pPIC9 under the control of AOX1 promoter and downstream the  sequence. To construct them, first DNA extraction was carried out from T. phaffii. Next, DNA quality was checked by PCR amplifying with ITS1 and ITS4 universal primers. First, TpBGL2 gene was amplified using BGL2F and BGL2R primers from T. phaffii total DNA in order to ligate it directly to pYES2.1/V5-His-TOPO® vector to construct the first vector (TpBGL2 gene in pYES2.1/V5-His-TOPO® under the control of GAL1 promoter) for intracellular expression in S. cerevisiae BY4741. After ligation, vectors were transformed into Escherichia coli cells and vectors were extracted from E. coli cells through minipreparation. The resulting vectors were further analyzed to investigate both the presence and the orientation of TpBGL2 gene in the vectors by constructing restriction patterns with MlyI and XbaI enzymes as well as by performing sequence analysis. In addition, PCR amplification was carried out using GAL1F and BGL2R primers. All results confirmed that the insert was in frame with GAL1 promoter. To construct the second and the third vectors, first TpBGL2 was amplified from T. phaffii total DNA with FW2 and RV2 primers having EcoRI and NotI restriction sites, respectively. TpBGL2 gene flanked by EcoRI and NotI restriction sites was ligated into pGEM-T Easy Vector by TA cloning. After transformation and cloning in E. coli cells, extracted primers were digested by EcoRI to confirm the presence of the insert. Next, both empty pPIC9 vectors and pGEM-T Easy vectors having TpBGL2 gene flanked by EcoRI and NotI restriction sites were digested by EcoRI and NotI enzymes. Then, they were ligated to construct the third vector (TpBGL2 gene in pPIC9 under the control of AOX1 promoter and downstream the  sequence). Both sequence analysis and PCR amplification with AOX1-BGL2R primer set confirmed that the insert was in frame with AOX1 promoter and  sequence. To construct the second vector (TpBGL2 gene in pYES2.1/V5-His-TOPO® under the control of GAL1 promoter and downstream the  sequence), TpBGL2 gene downstream the  sequence was amplified using ALFA and BGL2R primers and the amplicon was ligated into pYES2.1/V5-His-TOPO® vector. However, sequence analysis showed that the insert was in wrong orientation and no further studies were carried out with this vector. pYES2.1/V5-His-TOPO® + TpBGL2 vector was transformed into S. cerevisiae BY4741 strain for intracellular production of Kpkt killer toxin and the presence of the insert was confirmed by PCR analysis in S. cerevisiae transformants. The selection was carried out on YNB selective medium without uracil plates. One of the six transformants called T1 was cultivated in 2% (w/v) galactose and 2% (w/v) raffinose containing buffered yeast minimal medium. After 24 h and 48 h, sampling was carried out for crude extraction and for taking supernatant from the culture. Next, well plate assay was performed to investigate killer activity on buffered YPD plates spread by sensitive S. cerevisiae DBVPG 6500 strain to Kpkt killer toxin. T1 was also cultivated in 0.2% (w/v) galactose and 2% (w/v) raffinose containing buffered yeast minimal medium for 48 h and it was transferred into 2% (w/v) galactose containing minimal medium. After 24 h incubation, well plate assay was performed again for both crude extract and the supernatant of the culture. In addition, T1 was cultivated in 2% sucrose (w/v) containing buffered selective minimal medium and it was transferred into 2% (w/v) galactose containing buffered selective medium after 48 h of growth. Well plate assay was performed again after 24 h of growth in galactose containing medium. All studies showed that Kpkt killer toxin did not perform its killing activity when it was expressed intracellularly. Finally, the third vector (PIC9 + TpBGL2) was transformed into P. pastoris GS115 cells for extracellular expression of Kpkt in P. pastoris. To do that, P. pastoris cells were prepared to obtain competent cells for transformation which was carried out through electroporation. For transformation, linearized plasmids obtained by digesting with either SacI or BglII enzyme were utilized along with linearized empty pPIC9 vectors with the same enzymes. Selection was carried on minimal dextrose plates. Next, the transformants were grown on both minimal dextrose and minimal methanol plates to determine putative Mut+ (Methanol utilization plus) or MutS (Methanol utilization slow) phenotypes of the transformants since only Mut+ phenotypes can grow on methanol containing medium if the insertion results in functional AOX1 gene encoding alcohol oxidase, which is the main enzyme in methanol utilization pathway. Finally, transformants were subjected to PCR amplification using AOX1 and AOXR primers to investigate whether they have inserts. The evaluation of the killer activity of Kpkt killer toxin in P. pastoris is in progress.